超级化激活环核苷酸门控阳离子通道4、连接蛋白43和平足蛋白在小鼠胚胎心的表达与心传导系的发生

目的探讨小鼠胚胎心传导系的发生机制。方法用抗心肌肌球蛋白重链(MHC)、抗超级化激活环核苷酸门控阳离子通道4(HCN4)、抗缝隙连接蛋白43(CX43)和抗平足蛋白(podoplanin)抗体,对40只胚龄9～16d小鼠胚胎心进行连续石蜡切片并免疫组织化学或免疫荧光染色。结果胚龄9d,较强的HCN4阳性表达集中在MHC阴性的静脉窦壁,随心脏发育,HCN4较强阳性表达逐渐向窦房结转移。胚龄11d开始,CX43阴性表达显示部位特异性。CX43阴性染色经窦房结沿右心房背侧壁和左、右静脉瓣向房室管背侧壁延伸。胚龄13d,左、右静脉瓣与房间隔底部融合后,进一步延续为房室管背侧壁发育中的CX43阴性染色的房室结,继而与室间隔顶部CX43阴性的房室束相连。胚龄9～10d,在MHC阳性心肌、心包腔背侧壁脏壁中胚层心肌前体细胞及静脉窦周间充质均显示podoplanin阳性表达。胚龄11～13d,podoplanin阳性间充质细胞沿心脏外表面扩展形成podoplanin阳性间皮样心外膜。结论心脏发育早期,主起搏点位于静脉窦壁,起搏电位的产生早于收缩功能的发生。CX43阴性心肌是发育中的心传导系心肌,在胚龄11d即可观察到心传导系早期雏形。podoplanin参与促进心肌前体细胞向心肌细胞的分化。

超极化激活环核苷酸门控阳离子通道4基因与心脏节律发生、发展及预后的关系

超极化激活环核苷酸门控阳离子通道4基因在心脏节律的发生、发展及预后中有着重要的作用。研究表明,HCN4基因为窦房结起搏细胞产生自动节律的基础,也可影响心脏传导系统功能发育,其突变与病窦综合征有着密切的关系。通过HCN4起搏通道基因的转染技术构建生物心脏起搏器具有重要的生理意义。

超级化激活环核苷酸门控阳离子通道和心律失常

超级化激活环核苷酸门控阳离子通道(HCN)属于孔环离子通道超家族成员。该通道由细胞膜的超级化激活,对Na+和K+通透,产生内向电流(Ih),改变细胞的电学特性。HCN与心律失常的发生、调节和传导密切相关。该文针对HCN的结构功能、HCN与心律失常的动物实验和临床研究及其特异性阻滞剂伊伐布雷定的临床应用作一综述。

微波辐射对大鼠窦房结组织HCN4基因表达的影响

目的观察微波辐射对受损大鼠窦房结(SAN)组织超极化激活环核苷酸门控阳离子通道4(HCN4)基因表达的影响,探讨微波辐射致窦房结损伤的可能机制。方法将60只Wistar雄性大鼠随机分为假辐射组和50 mW·cm-2组,每组30只,建立微波辐射致窦房结损伤大鼠模型,于辐射后1、7、14、28 d及3、6个月,采用原位杂交法检测窦房结HCN4 mRNA表达变化。结果与假辐射组比较,50 mW·cm-2组大鼠于辐射后1、7、14、28 d,窦房结细胞胞质内HCN4 mRNA表达显著增加;而于辐射后3、6个月显著减少,其差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。结论HCN4异常表达是微波辐射致SAN损伤的重要致伤分子之一。

风湿性二尖瓣狭窄心房颤动患者HCN4基因cDNA序列测定及mRNA的表达

目的通过分析风湿性心脏病二尖瓣狭窄患者心房肌组织超级化激活环核苷酸调控通道基因家族4(HCN4)基因表达与心房颤动发生的关系,为探讨心房颤动发生的机制奠定理论基础。方法52例风湿性二尖瓣狭窄患者,根据是否合并心房颤动将其分为两组,实验组:38例,男18例,女20例;年龄26～68岁,平均年龄46.47岁;均合并心房颤动。对照组:14例,男6例,女8例;年龄21～62岁,平均年龄42.93岁;不合并心房颤动。提取并逆转录两组患者心房肌组织中HCN4基因的总核糖核酸(RNA),应用SYBR GreenⅠ荧光染料,建立检测HCN4基因信使RNA(mRNA)的实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)法,并对PCR产物测序进行分析。根据标准曲线计算出两组心房肌组织中HCN4基因mRNA含量,并以HCN4基因mRNA和内参β肌动蛋白(β-actin)含量的比值作为评价HCN4基因mRNA表达水平指标。结果测定HCN4基因cDNA序列同源性为100%。建立的实时荧光定量PCR方法在103～107拷贝数/μl的标准品梯度稀释范围内r为0.999。实验组HCN4基因mRNA与β-actin含量的相对表达值比值与对照组比较明显升高(1.323±1.226 vs.0.116±0.192,P<0.05)。结论实时荧光定量PCR对HCN4基因mRNA能进行准确定量,HCN4基因的过度转录表达提示其可能参与了调控风湿性二尖瓣狭窄心房颤动的发生过程。

转染人TBX18基因的大鼠心脏成纤维细胞中HCN4蛋白表达、If及对心肌细胞搏动频率的影响观察

目的：观察转染人TBX18基因的大鼠心脏成纤维细胞HCN4蛋白表达、超极化激活内向离子电流（If）及对心肌细胞搏动频率的影响。方法取新生SD大鼠，断头处死后取心脏，分离培养成纤维细胞及心肌细胞。构建人TBX18基因的腺病毒载体Ad-GFP-TBX18，包装并纯化病毒滴度至1＆#215;1010 TU／mL。取传代2～5代时对数生长期新生大鼠成纤维细胞分为A、B、C组，培养24 h后A、B组分别转染Ad-GFP-TBX18、腺病毒载体pHBAd-MCMV-GFP（阴性对照），C组不做任何处理。采用RT-PCR法检测各组细胞TBX18 mRNA。采用Western blotting法检测各组超极化激活环核苷酸门控阳离子通道4（HCN4）蛋白。采用电压钳记录各组细胞超极化激活内向离子电流（If）。将各组细胞与新生大鼠心肌细胞共培养，观察新生大鼠心肌细胞搏动频率。结果 A、B、C组TBX18 mRNA相对表达量分别为98．32±6．21、1．03±0．05、1．02±0．02。A组TBX18 mRNA相对表达量高于B、C组（P均＜0．05）；B、C 组TBX18 mRNA相对表达量差异无统计学意义。A、B、C组HCN4蛋白相对表达量分别为0．49±1．21、0．12±0．02、0．09±0．01。A组HCN4蛋白相对表达量高于B、C组（P均＜0．05）；B、C组HCN4蛋白相对表达量差异无统计学意义。A组约有30％的细胞可以检测到If，而B、C组中没有细胞检测到If。同一时点A组新生大鼠心肌细胞搏动频率高于B、C组（P均＜0．05）；B、C组新生大鼠心肌细胞搏动频率差异无统计学意义。结论转染人TBX18基因的大鼠心脏成纤维细胞高表达HCN4蛋白，存在If电流，并能促进共培养新生大鼠心肌细胞的搏动。

益阳活血方对损伤兔窦房结组织HCN4蛋白表达的影响

目的通过研究中药复方益阳活血方对损伤的兔窦房结组织超级化激活环核苷酸门控阳离子通道4(Hyperpolarization-activated cyclic nucletide-gated cation channel 4,HCN4)表达的影响,探讨其治疗病态窦房结综合征的可能机制。方法取60只大耳白兔(体质量2.3～2.8 kg),随机分为正常组,模型组,阿托品组,益阳活血方高、中、低剂量组,每组10只,除正常组不造模外,余各组采用甲醛加压注射渗透法建立兔窦房结组织损伤模型,模型稳定后开始给药,疗程(7 d)结束后取材,免疫组织化学方法观察窦房结HCN4表达的变化。结果免疫组化染色示窦房结HCN4表达主要位于结中央区,向周边逐渐减少。与正常组相比,造模后各组家兔窦房结组织HCN4蛋白表达均有不同程度降低(P<0.05或P<0.01)。与模型组比较,各用药组IOD值均有不同程度升高,差异有统计学意义(P<0.01),且高剂量组明显优于中、低剂量组及阿托品组(P<0.01),中、低剂量组与阿托品组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论益阳活血方可提高损伤兔窦房结组织HCN4蛋白的表达,可能是治疗病态窦房结综合征的机制之一。

苍白球HCN通道对帕金森病僵直症状的影响

目的探讨苍白球超级化激活环核苷酸门控阳离子(HCN)通道对氟哌啶醇所致帕金森病大鼠僵直症状的影响。方法大鼠单侧苍白球埋置套管,恢复3d后腹腔注射氟哌啶醇5mg/kg,在苍白球内微量注射生理盐水(生理盐水对照组)以及HCN通道特异性阻断剂ZD7288(0.5mmol/L,实验组),观察其对氟哌啶醇导致的大鼠僵直症状的影响。结果生理盐水对照组大鼠无明显偏转行为;实验组9只大鼠中有4只表现出明显的对侧偏转行为,大鼠头部-背部直线与背部-尾部直线所呈夹角评分与生理盐水对照组比较差异有显著性(u=132.500,P<0.001);另外5只表现为明显的同侧偏转行为,其评分与生理盐水对照组比较差异有统计学意义(u=9.000,P<0.001)。结论 HCN通道可能通过对苍白球神经元兴奋性的不同作用诱发大鼠出现不同的偏转行为。

HCN4与心脏生物起搏研究进展

HCN4作为超极化激活环核苷酸门控阳离子通道（HCN）基因家族在心脏中表达的主要亚型，负责编码产生起搏电流，被称为起搏基因。近年来，利用病毒载体转染HCN4基因来构建心脏生物起搏器取得了较大进展，但目前尚局限于动物实验阶段，其应用于临床实践还有很多问题需要研究解决。现将HCN4与心脏生物起搏研究进展作一综述。

HCN4基因在大鼠心脏不同发育时期的表达

目的探讨超极化激活环核苷酸门控阳离子通道4(HCN4)基因在大鼠心脏发育过程中心房、心室中的表达及其在心脏发育过程中的意义。方法取妊娠15、19d(E15、E19)胎鼠和出生2、10、35、90d(P2、P10、P35、P90)幼鼠心脏,于体视显微镜下分离其心房和心室。抽提总RNA,应用RT-PCR法对HCN基因mRNA表达进行半定量分析;抽提膜蛋白,应用Westernblot方法对HCN蛋白的表达进行半定量分析,应用SPSS11.5软件进行统计学分析。结果HCN4基因mRNA和HCN4基因蛋白在大鼠各时间点心房和心室中均有表达。心房或心室内HCN4基因mRNA在P10、P35、P90时两两比较均无显著性差异(Pa>0.05);E15、E19、P2、P10两两比较均有显著性差异(Pa<0.05)。心房HCN4基因mRNA及其蛋白相对表达量(HCN4/β-actin)均较同日龄心室高,差异均有统计学意义(Pa<0.05)。心房或心室内HCN4基因mRNA在E15时均表达最高,在E19、P2、P10时表达逐渐降低,与E15比较差异有统计学意义(P<0.05)。心脏发育后期(P35、P90)表达量趋于平衡。Westernblot与RT-PCR结果基本一致。结论随着大鼠心脏的发育成熟,HCN4基因在心房和心室的表达呈逐渐下调趋势,可能与大鼠心脏的发育成熟密切相关。

流式细胞术检测风湿性心脏病合并心房颤动患者HCN2蛋白的表达

目的对风湿性心脏病合并心房颤动患者右心耳组织超级化激活环核苷酸门控阳离子通道-2(HCN2)蛋白的表达进行分析和研究。方法风湿性心脏病患者84例分为研究组(心房颤动)和对照组(窦性心律),每组42例,对两组临床资料进行回顾性分析。结果研究组患者的左心房内径(LAD)、右心房内径(RAD)、左心室舒张末期内径(LVEDD)明显高于对照组,右心室内径(RVD)明显小于对照组,两组比较差异具有统计学意义(P<0.05);且研究组HCN2蛋白表达水平高于对照组。结论风湿性心脏病合并心房颤动患者HCN2蛋白的表达与患者的心房颤动具有相关性。

体外诱导心肌样细胞中HCN4过表达对起搏电流特性的影响

目的体外构建具有表达功能性的起搏心肌样细胞,并检测起搏心肌样细胞中起搏电流的特性。方法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞诱导分化为心肌样细胞。构建携带人HCN4基因的重组腺病毒载体(rAd/GFP/HCN4)和绿色荧光蛋白的腺病毒载体(rAd/GFP),转染至心肌样细胞分为rAd/GFP/HCN4组和rAd/GFP组,不做任何处理作为对照组。Western blot检测各组HCN4蛋白表达,全细胞膜片钳技术记录各组中起搏电流情况。结果荧光显微镜观察到长梭形心肌样细胞,PCR鉴定重组腺病毒载体rAd/GFP/HCN4和rAd/GFP构建成功;rAd/GFP/HCN4组HCN4蛋白相对表达量(1.31±0.02)高于rAd/GFP组(0.55±0.02)和对照组(0.52±0.03)(P<0.05),rAd/GFP组与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05);膜片钳实验在转基因细胞中检测到起搏电流,而rAd/GFP组和对照组中未检测到起搏电流。结论 rAd/GFP/HCN4转染到心肌样细胞中,心肌样细胞中HCN4蛋白表达增加且可检测到起搏电流,从而使心肌样细胞具有自主搏动,为体外构建生物起搏器提供研究基础。

HCN2与HCN4在风湿性心脏病二尖瓣狭窄患者并发心房颤动中的协同表达

目的:分析超极化激活环核苷酸调控通道基因家族-2(HCN2)基因及超极化激活环核苷酸调控通道基因家族-4(HCN4)基因在风湿性心脏病二尖瓣狭窄(风心二狭)患者并发心房颤动中的协同表达作用,探讨其并发心房颤动的机制。方法:收集43例风心二狭患者右心耳组织,实验组为并发心房颤动患者(AF组),对照组为窦性心律患者(SR组)。采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)及荧光定量PCR(FQ-PCR)检测HCN2及HCN4的表达,分析两者的相关性。结果:RT-PCR及FQ-PCR结果均显示,AF组HCN2及HCN4表达量均高于SR组(P<0.01),AF组HCN2与HCN4表达上调率均呈现正相关(r1=0.697,P1<0.01;r2=0.659,P2<0.01)。结论:HCN2与HCN4的协同表达作用在风湿性心脏病二尖瓣狭窄患者并发心房颤动的发生发展中起重要的作用。