基于色谱法的超螺旋质粒DNA纯化与分析进展

质粒DNA含有独立复制的遗传结构,是基因工程的常用工具,广泛应用于分子生物学基础研究、农业转基因检测、医疗诊断与基因治疗等领域。质粒DNA的构型一般分为超螺旋、开口环状及线性3种。初步纯化的质粒DNA溶液中常混有3种构型,并且掺杂一定量的蛋白质、RNA、内毒素以及宿主基因组DNA,这些杂质会影响后续的应用,因此质粒DNA需要进一步精细纯化。该文对质粒DNA的新应用领域、基于色谱的精细纯化技术及产物质量分析体系进行了综述,并展望了高纯度质粒DNA精细纯化及产物分析的发展方向。

发酵培养中葡萄糖对超螺旋质粒DNA产量的影响

本文首先研究了含有不同质量浓度葡萄糖的发酵培养基对超螺旋质粒DNA产量的影响。结果表明,发酵培养基中最佳葡萄糖的质量浓度为2 00g L。此培养基与未添加葡萄糖的培养基相比,超螺旋质粒DNA产量提高2 56倍;菌体密度提高1 26倍。其次研究了优化培养基下影响超螺旋质粒DNA产量的各参数变化规律。

混合模式层析分离纯化超螺旋质粒DNA

针对细胞裂解液中的超螺旋质粒DNA(sc pDNA)的分离,以质粒pVAX1为典型对象、采用Capto PlasmidSelect作为混合模式层析介质,探讨了料液中主要成分sc pDNA、开环质粒DNA(oc pDNA)和RNA的吸附行为,优化了分离条件,实现了从成分较为复杂的料液中高效分离sc pDNA。考察了上述3种组分的静态吸附,发现在(NH_(4))_(2)SO_(4)浓度c(NH_(4))_(2)SO4为1.9~2.5 mol·L^(-1)时,sc pDNA均具有较高的吸附量,确定c(NH_(4))_(2)SO_(4)=2.5 mol·L^(-1)的料液可直接上样,此时sc pDNA饱和吸附量为每克介质吸附3.3 mg。动态吸附实验发现,sc pDNA穿透略晚于oc pDNA,sc pDNA动态载量为每毫升介质负载2.00 mg,RNA吸附能力明显强于pDNA。进一步优化了洗脱、冲洗和上样量等分离条件,采用c(NH_(4))_(2)SO_(4)=2.5 mol·L^(-1)上样、c(NH_(4))_(2)SO_(4)=1.9 mol·L^(-1)冲洗、(c(NH_(4))_(2)SO_(4)=1.7 mol·L^(-1))+(cNaCl=0.3 mol·L^(-1))洗脱,sc pDNA纯度可达83.9%、同质性高达95.8%、收率为80.6%。结果表明,混合模式层析对sc pDNA选择性好、处理量较大,具有良好的应用价值。

用质粒作底物测定核糖体失活蛋白酶活性的新方法

植物核糖体失活蛋白(ribosome-inactivating protein,RIP)是一类能作用于核糖体最大RNA的独特蛋白质.它是研究蛋白质生物合成中核糖体RNA结构与功能的有力工具.利用RIP能在DNA中脱去一些腺嘌呤碱基使超螺旋DNA解旋的特点,分别以常用的质粒PUC18、PUC19和PBR322 DNA为底物,建立了测定RIP酶活性的一种新方法,其灵敏度是50ng(天花粉蛋白)和5ng(还原型的辛纳毒蛋白),酶催化反应的时间是60min.这个新方法具有方便、快捷、灵敏的特点,避免了常用方法中制备核糖体、提取RNA的仪器和技术条件的限制,检测的时间由原来的几天缩短到约120min,大大地降低了检测的费用,为广泛和深入地研究RIP提供了有利的条件.

用分析色谱方法检测核酸疫苗中超螺旋构象质粒的比例

为建立阴离子分析色谱法用于检测核酸疫苗中各种构象的质粒所占的比例.以中高压层析系统(如AKTA Purifier)和Mono Q FPLC分析柱为基础建立分析平台,通过软件计算各层析峰的面积从而得到各种构象(特别是超螺旋构象)的质粒所占的比例.检测过程可以在30 min内完成,样品中各种组分分离完整,层析峰面积计算有效,检测结果客观准确.该方法克服了传统方法人为因素影响大的缺点,达到了较高的精度.不但能够用于核酸疫苗半成品和成品的质控,还能够应用于疫苗工艺开发和生产过程的控制,为工艺优化和生产环节的质控提供依据.

溴代色胺酮铁(Ⅱ)配合物的合成、晶体结构及与DNA的作用研究

以天然的生物碱色胺酮(Try)为起始原料,合成了卤代衍生物8-溴色胺酮和其铁配合物[Fe(8-Br-Try)4](1)。X单晶衍射分析表明,配合物1是由中心铁(Ⅱ)原子与两个8-溴色胺酮配体三齿螯合配位,形成一个六配位的变型八面体几何构型。采用紫外吸收光谱和荧光光谱等分析方法研究了配合物1与G-四链体HTG21DNA的相互作用,发现这个化合物与DNA的结合能力较强,它与DNA的紫外结合常数为8.70×10~6 dm^3·mol^(-1)。琼脂糖凝胶电泳实验进一步表明,配合物1能对pUC19质粒DNA产生切割作用。

苦瓜籽MAP30酶活性试验研究

建立一种快速、高效检测MAP30酶活性的方法,并初步研究其部分生物活性。利用MAP30能以PET28a DNA为底物并脱去一些腺嘌呤碱基使超螺旋DNA解旋的特点,建立了测定MAP30酶活性的一种新方法,检测MAP30的酸碱和温度酶活性。MAP30灵敏度1μg,酶催化反应的时间是30 min。最适温度和p H值是37℃和8.0。不同p H值环境对MAP30特性的影响是不同的,酸性越强或碱性越强对MAP30的影响越大。不同温度值环境对MAP30特性的影响是不同的,温度越高MAP30活性损失。因此,合适的酸碱和温度为广泛和深入地研究MAP30酶活性提供了有利的条件。