利用分析超速离心技术探究异丙醇在抗体蛋白高聚体含量分析中的作用

蛋白抗体聚集是影响药物质量的原因之一。体积排阻色谱(SEC)技术是蛋白质药物聚集体表征的常用方法,但由于制剂配方与SEC流动相较难完全一致,会引起蛋白单体非共价聚集分布,影响聚集体测定结果。本研究采用分析超速离心-沉降速率技术与体积排阻-多角度静态光散射技术以及动态光散射技术相结合的方法,研究了单克隆抗体及抗体偶联药物在添加10%异丙醇的体积排阻色谱流动相体系中单体和二聚体百分含量的变化规律。结果表明,异丙醇有助于消除单体间相互作用,降低非共价二聚体形成,并起到稳定蛋白单体形态及蛋白构象的作用,为体积排阻色谱法分析易聚集蛋白提供了更加准确的结果。在高盐添加10%异丙醇的流动相体系中,分析超速离心分析得到的分子质量、单体纯度、蛋白摩擦系数、水合半径、轴长比等水力学参数均可达到与制剂缓冲液一致的结果,说明流动相中添加低比例的异丙醇可以得到更高的单体含量,与实际治疗的制剂状态具有等同意义。本研究表明,将体积排阻色谱-多角度静态光散射与分析超速离心技术相结合可以有效地分析抗体蛋白的纯度和聚集形态,是抗体蛋白质量分析及制剂筛选的可靠手段。

毛细管超速离心法在临床输血无效患者血型鉴定中的应用价值

【目的】探讨毛细管超速离心法在临床输血无效患者的血型鉴定中的临床应用价值。【方法】纳入两院2019年1月至2020年5月收治的15例输血无效患者为研究对象,采用毛细管超速离心法鉴定患者是否为Rh血型,并对患者的血型鉴定及抗体筛查结果进行分析。【结果】通过毛细管超速离心法检测,15例患者中基本确定了2例疑难血型患者血型为O型血,同时辅助鉴定了13例患者的不规则抗体特性。【结论】毛细管超速离心法可用于临床输血无效患者的血型鉴定,能够为患者输血安全提供有效保障。

不同等电点沉淀法和超速离心法提取牛奶乳清蛋白的双向电泳分析

为探索牛奶乳清蛋白提取的最适方法,以生鲜荷斯坦牛奶为对象,采用不同等电点(pH 4.6和pH 4.8)沉淀法和超速离心法提取牛奶乳清蛋白样品,并对提取效果进行双向凝胶电泳(two-dimensional electrophoresis,2-DE)图谱分析。依据凝胶图谱上蛋白斑点比较图谱质量,采用PDQuest 8.0凝胶图像分析软件进行凝胶图谱分析。结果显示:2种方法均能有效提取牛奶乳清蛋白,且获得的2-DE凝胶图谱背景清晰、蛋白点个体独立、无明显的拖尾现象,且重复性强,但都存在一定的酪蛋白残留。与超速离心法相比,pH 4.6沉淀法和pH 4.8沉淀法提取乳清蛋白的2-DE凝胶图谱可检测到较多的蛋白质斑点。pH 4.6沉淀法提取乳清蛋白制备的2-DE凝胶图谱中蛋白点的表达丰度略高于pH 4.8沉淀法。研究表明:pH 4.6沉淀法提取乳清蛋白制备2-DE凝胶图谱略优于pH 4.8沉淀法和超速离心法。但2种等电点沉淀法和超速离心法都可有效去除牛奶中的高丰度酪蛋白,提高低丰度蛋白的检出敏感性。

两步超速离心法快速分离大量血浆极低密度脂蛋白及低密度脂蛋白

本法先使血浆中的脂蛋白快速富集浓缩，再将脂蛋白各组份分离纯化。即具备序列漂浮法分离样品量大的长处，又具有密度梯度法离心时间短的优点。使用ＢＥＣＫＭＡＮＬ８－８０Ｍ型超速离心机，Ｔｙｐｅ７０Ｔｉ转头，分离２８０ｍｌ血浆只需超速离心５ｈ。所得极低密度脂蛋白（ＶＬＤＬ）及低密度脂蛋白（ＬＤＬ）经琼脂糖电泳、聚丙烯酰胺电泳（ＰＡＧＥ）及载脂蛋白ＳＤＳ－聚丙烯酰胺电泳（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）鉴定纯度良好。本文为超速离心分离制备大量血浆ＶＬＤＬ、ＬＤＬ提供了一种快速、经济的新方法。

超速离心浓缩技术富集HBV和HCV颗粒的效果研究

目的分析超速离心浓缩(简称超浓缩)技术对HBV和HCV病毒颗粒的富集效果。方法将8份不同浓度的HBV阳性标本(10、102、103IU/ml各2个、104和105IU/ml各1个)和9份不同浓度HCV阳性标本(102IU/ml 1个、103 IU/ml 3个、104 IU/ml 3个,105、106IU/ml各1个),4℃24 600 g超速离心1 h,9.6倍浓缩富集病毒;使用Roche COBAS AmpliPrep/COBAS Taq-Man HBV及HCV定量试剂盒对原标本及浓缩标本做HBV及HCV定量测定,计算病毒回收率。结果经9.6倍超浓缩处理后,8份HBV阳性标本的病毒含量均明显上升,平均是原标本的(5.92±1.98)倍,浓缩处理的病毒回收率为(61.65±20.67)%;9份HCV阳性标本的病毒含量亦均明显上升,平均是原标本的(4.70±1.43)倍,浓缩处理的病毒回收率为(48.95±14.84)%。结论超速离心处理可有效富集HBV及HCV颗粒,病毒浓缩效果显著。

蔗糖垫超速离心法提纯乙型脑炎疫苗

经Vero细胞培养的P3株乙脑灭活病毒，以超滤浓缩和硫酸色精蛋白处理后，40％蔗糖垫层在27500r／min离心6小时，收集沉淀制成提纯乙脑疫苗。其蛋白含量在0．012～0.035mg／ml，稀释8倍后其疫苗效价仍能超过日本提纯鼠脑乙脑疫苗参考标准和我国乙脑疫苗参考标准。Vero细胞残余DNA＜100pg／0．5ml，残余牛血清＜1μg／ml。

中国明对虾血浆蛋白质组学研究中高丰度蛋白的超速离心去除技术

应用超速离心技术对中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)血浆样品进行处理,比较去除和未去除高丰度蛋白血浆的双向凝胶电泳(2-DE)图谱。结果表明:对虾血浆高丰度蛋白经去除后,血浆样品中的低丰度蛋白得到较好的分离和浓缩。未处理样品的2-DE图谱分离的蛋白质170个,而去除高丰度蛋白后血浆2-DE图谱上分辨率增高,分离出蛋白质点520个,一些低丰度蛋白质被有效分离出来。研究证实,超速离心技术可有效去除对虾血浆高丰度蛋白(血蓝蛋白),提高低丰度蛋白的检出敏感性,为对虾等甲壳动物的血浆蛋白质组学研究提供了基础保障。

超速离心在中药颗粒剂中的应用

超速离心在中药颗粒剂中的应用余琪王溶溶陈丹菲倪晟（浙江省中药研究所，杭州３１００３２）主题词：＠颗粒剂／生产和制备超速离心法按一般颗粒剂制粒工艺所制成的颗粒剂，服用量大是普遍存在的问题，对于一些含固量较高的中药方剂更甚。笔者在研制由黄芪、百合、天冬、...

超速离心和酸沉淀制备牛乳清的蛋白质组学研究

本研究旨在对超速离心法和酸沉淀法鉴定的乳清蛋白进行分析,并比较不同样品制备方法对乳清蛋白组鉴定结果的影响。采集牛奶样品去除脂肪,利用超速离心和酸沉淀法制备乳清蛋白,液相色谱串联质谱分析结合数据库搜索鉴定,比较两种方法制备的乳清蛋白的差异,分析了差异蛋白参与的生物过程、细胞组成和分子功能等。聚类分析和主成分分析展示了两种样品制备方法的差异蛋白,超速离心方法鉴定的表达量增加的蛋白有53个,包括β-酪蛋白、糖基化依赖细胞黏附分子1和多聚免疫球蛋白受体等;酸沉淀方法鉴定的表达量增加的蛋白有21个,包括CD9抗原、β2-微球蛋白和β-乳球蛋白等。将两种方法获得的差异蛋白根据蛋白注释分类发现,超速离心法中高表达的蛋白主要位于胞外区域、囊泡、内膜系统、内质网和高尔基体等,涉及蛋白结合、酶调节活性、受体结合和抗氧化活性等;酸沉淀法中高表达的蛋白主要位于胞外区域和囊泡等,涉及结合、核酸酶活性和离子结合等。结果提示,两种方法鉴定的蛋白质组表达模式存在差异,乳清蛋白样品制备方法的结合可以获得更多的鉴定蛋白,为乳清蛋白组学研究中样品制备方法的选择提供参考依据。

分析超速离心技术及其在分子生物学中的应用

分析超速离心技术是生物化学和分子生物学中的一种经典方法。该技术是基于热力学和流体动力学第一定律,利用分析超速离心机研究蛋白、核酸和聚合物及其他各种复合物在溶液状态下的行为。从该技术利用的仪器、原理和数据分析方法及其在分子生物学中的应用等方面进行了综述,并对这一技术在现阶段的应用进行了总结和展望,以期为国内相关领域研究人员提供参考。

毛细管超速离心法在输血后患者Rh血型鉴定中的应用分析

目的探讨毛细管超速离心技术在输血后患者Rh血型鉴定中的应用。方法对送检的10例抗体筛选阳性、Rh抗原鉴定为混合视野的患者红细胞,洗涤制备压积红细胞,应用毛细管超速离心技术进行分离,分别取近心端和远心端红细胞进行Rh血型鉴定。结果 10例患者标本经毛细管离心分离后,均能准确鉴定Rh血型,而且可以辅助鉴定抗体类型。结论毛细管超速离心技术可较好地分离输血后患者红细胞,进而准确鉴定患者血型,值得在临床输血中推广使用。

超速离心高效液相色谱准确测定血清脂蛋白(a)胆固醇

目的建立血清脂蛋白(a)胆固醇的准确测定方法。方法血清与含脯氨酸的溴化钠溶液混合,使背景密度为1.044,超速离心;用含2-巯基乙醇的溴化钠溶液将底部组分的密度调节至1.040,再次超速离心,高效液相色谱测定顶部组分胆固醇即为脂蛋白(a)胆固醇。结果用2-巯基乙醇使脂蛋白(a)解离,使成为不含载脂蛋白(a)的脂蛋白(a),脂蛋白(a)解离前后存在明显密度分界区域,使脂蛋白(a)的分离和测定成为可能。测定脂蛋白(a)胆固醇的批内和总变异系数分别为1.84%～2.17%和2.85%～4.29%。结论建立新的血清脂蛋白(a)胆固醇测定方法,方法精密、可靠,可望在脂蛋白(a)测定标准化中发挥作用。

血清高密度脂蛋白的超速离心、氧化修饰及DiI标志

目的:探讨一种方便快捷地从血浆中分离高密度脂蛋白(HDL)及氧化修饰、荧光标记的方法。方法:采用一次性密度梯度超速离心法,经超速离心分离后获得HDL(10℃,50000r/min,5h),并用Cu2+进行氧化修饰(37℃,50μmol/L,24h)及DiI进行荧光标记(37℃,15mg/mL,15h)。结果:5h内成功分离出脂蛋白,并氧化、标记了HDL;琼脂糖凝胶电泳、Bradford蛋白质定量及MDA测定证实其为纯度和浓度较高的HDL及氧化HDL(OX-HDL);标记的HDL(DiI-HDL)结合到体外培养的ECV-304细胞,表明DiI-HDL保持了正常脂蛋白的配体功能。结论:本方法缩短了超速离心时间并降低了标记成本,效果理想,可成功应用于脂蛋白受体的研究。

适配器-超速离心法提高电镜检测病毒的灵敏度

通过专用超速离心机将病毒直接离心至载网是重要的提高诊断电镜灵敏度的方法,作者尝试建立适配器-超速离心法实现相同目的。设计制造了外形类似离心管的载网适配器,其内部有一平底的凹槽,可以放置电镜载网,添加病毒悬液后,经过超速离心,能够将病毒粒子直接离心到载网上。利用重组腺病毒和重组腺相关病毒为模式病毒,适配器-超速离心法较悬滴法的病毒检测灵敏度提高了50～200倍;对人腺病毒41型(Ad41)细胞培养物进行电镜检测,灵敏度提高了50倍。如果将免疫凝集法(immune clumping)与适配器-超速离心法相联合进行电镜制样,检测灵敏度较常规免疫凝集法提高1～2个数量级。这些结果说明适配器-超速离心法能够高效地富集病毒,可以应用于病毒的电镜检测工作。

超速离心法分离泡相胆汁

胆汁中的磷酯泡是胆固醇的主要携带者，在一般情况下，泡处于稳定状态，一旦存有影响其稳定性的因素，则单层泡趋于集聚成复层泡，进而胆固醇结晶成核乃至成石［１］。上述因素可能是泡相胆汁中的蛋白质［２］，后者仅占胆汁蛋白的２％［４］。本实验的目的在于通过超速离...

试剂盒法与差速超速离心法所提血清外泌体的形态学比较

目的：比较常用的外泌体提取方法，获得可靠有效的血清外泌体提取方法。方法：电镜下观察鉴定差速超速离心法、试剂盒法及组合优化方法所提外泌体的形态；蛋白印迹法检测外泌体标志蛋白CD63的表达。结果：差速超速离心法提取的外泌体呈茶托样双层膜结构，直径100nm左右；试剂盒法提取的外泌体颗粒多，大小50～200nm之间，无明显的立体结构，经差速超速离心法纯化后形态与差速超速离心法类似，经试剂盒法纯化后与仅使用一次试剂盒提取的外泌体无明显形态差异；四种方法所提外泌体表达标志蛋白CD63。结论：差速超速离心法是更为可靠且有效的外泌体提取方法。