基于体温扩增的唐菖蒲伯克霍尔德氏菌椰毒致病变种3种可视化快速检测方法的建立

为实现食品中唐菖蒲伯克霍尔德氏菌椰毒致病变种(Burkholderia gladioli pv. cocovenenans)的快速检测,基于体温扩增技术——酶促重组等温扩增(enzymatic recombinase amplification,ERA),并根据唐菖蒲伯克霍尔德氏菌椰毒致病变种bonM基因序列设计和筛选了ERA检测引物和探针,分别建立ERA显色法、荧光法、试纸条法3种可视化快速检测方法,并评估其特异性和灵敏度,以及在市售样品检测适用性和准确性。结果显示,建立的方法对3株唐菖蒲伯克霍尔德氏菌椰毒致病型菌株均有扩增,其他常见的食源性致病菌以及其他唐菖蒲伯克霍尔德氏菌均无扩增,说明检测方法的特异性良好。3种方法的检出限均为10^(-2)ng/μL,灵敏度较好。采用建立的3种可视化快速检测方法对15份市售样品进行检测,检出阳性2份,检出率为13.3%。该结果与国标方法的检测结果一致,说明方法具有较好的适用性和准确性。本研究建立的基于体温扩增技术的显色法、荧光法和试纸条法具有较高的特异性及灵敏度,37℃体温扩增15 min左右即可获取检测结果,且裸眼可视,可为食品中唐菖蒲伯克霍尔德氏菌椰毒致病变种的现场可视化快速筛查提供新型简便的策略。

食品中唐菖蒲伯克霍尔德氏菌实时荧光PCR检测的研究

目的:建立唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的核酸检测方法。方法:根据16S~23S rRNA基因片段序列,利用Oligo7设计TaqMan探针及引物,并验证实时荧光PCR检测方法的特异性和灵敏性。结果:用实时荧光PCR检测方法检测15株标准菌株,只有唐菖蒲伯克霍尔德氏菌呈阳性,验证了此方法具有良好的特异性。灵敏度实验中得出菌液灵敏度为5.8×10~2 CFU·mL^(-1),DNA灵敏度为7.2×10^(-4) ng·μL^(-1)。结论:建立的实时荧光PCR检测方法有良好的特异性和灵敏度,该方法可用于唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的快速检测,具有较好的应用价值。

新洋葱伯克霍尔德氏菌YM12的分离鉴定及其对黄瓜软腐病的防治效果

黄瓜软腐病是由巴西果胶杆菌Pectobacteriumbrasiliense引起的一种细菌性病害,该病害发生严重且难防难控,以筛选具有高效抑菌作用的生防微生物为目的,本研究在黄瓜根际土壤中分离得到了一株对巴西果胶杆菌具有显著抑制效果的菌株YM12。经形态学观察、生理生化特征测定及多基因系统发育树分析,鉴定其为新洋葱伯克霍尔德氏菌Burkholderia cenocepacia;抗生素合成基因检测结果表明,菌株YM12具有产生硝吡咯菌素pyrrolnitrin与藤黄绿脓菌素pyoluteorin的能力;其他生防性状分析表明,YM12具有溶磷能力,还可产生蛋白酶及嗜铁素。经抑菌谱分析,菌株YM12能够抑制5种病原细菌及3种病原真菌的生长。盆栽试验结果表明,菌株YM12对黄瓜软腐病具有明显的防治效果,防效可达62.84%,优于对照药剂春雷霉素。综上,菌株YM12是目前首次报道的对细菌性软腐病具有良好生防效果的新洋葱伯克霍尔德氏菌。

树木伯克霍尔德氏菌DHR18诱导橡胶树抗病性相关防御酶分析

为探究树木伯克霍尔德氏菌(Burkholderia arboris)DHR18诱导橡胶树对胶孢炭疽菌优势种(Colletotrichum siamense)的抗性,以橡胶树苗GT1为材料,检测不同浓度的树木伯克霍尔德氏菌DHR18发酵液处理以及DHR18与胶孢炭疽菌CH-1协同处理下橡胶树叶片中多酚氧化酶(polyphenol oxidase,PPO)、过氧化氢酶(catalase,CAT)、过氧化物酶(peroxidase,POD)、苯丙氨酸解氨酶(phenylalanin ammonialyase,PAL)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)5种防御相关酶的活性变化。结果表明:经3个浓度(1×10^(8)、1×10^(7)、1×10^(6) CFU/mL)的DHR18发酵液处理后,橡胶树叶片中CAT、POD、PAL、SOD和PPO活性均高于对照,其中1×107CFU/mL浓度处理的5种防御酶活性最高,防御酶活峰值分别为1 009.14、29 138.67、110.24、902.42、148.00 U/g,分别是对照的2.68倍、3.35倍、1.88倍、3.97倍、4.51倍。树木伯克霍尔德氏菌DHR18与胶孢炭疽菌CH-1协同处理下,先喷施DHR18处理组的5种防御酶活性均高于其他处理组,显著高于对照,其CAT、POD、PAL、SOD和PPO活性峰值分别为1 230.85、45 504.67、117.53、1342.17、134.40 U/g,分别是对照的4.56倍、3.10倍、2.04倍、3.28倍、5.98倍;菌株DHR18对胶孢炭疽菌的平板抑制率为71.56%,在橡胶树苗上对胶孢炭疽病预防效果为81.79%,防治效果为44.35%。研究结果表明,树木伯克霍尔德氏菌DHR18可促使橡胶树防御相关酶的活性提高,诱导橡胶树产生系统抗性,诱导抗病性可能是树木伯克霍尔德氏菌DHR18拮抗胶孢炭疽病的原因之一。

吡咯伯克霍尔德氏菌JK-SH007产脂肪酶发酵条件优化及酶学特性

为提高内生生防菌吡咯伯克霍尔德氏菌JK-SH007发酵产脂肪酶的能力,并确定该菌株脂肪酶的酶学性质,通过单因子试验和正交设计试验,优化该菌株产脂肪酶的发酵培养条件,初步考察了温度、pH、金属离子和有机溶剂对其活性的影响。结果显示:JK-SH007菌株产脂肪酶最优培养基组成及发酵条件为:葡萄糖15 g/L,蛋白胨20 g/L,K2HPO42.5 g/L,花生油400μL/50 mL,初始pH 8.0,发酵温度33℃。该脂肪酶反应最适温度为60℃,且在50~60℃条件下具有良好热稳定性;反应最适pH为8.0,在pH 5.0~10.0活性稳定;该脂肪酶对甲醇、乙醇、乙酸乙酯的耐受性好,具有较高甲醇抗性。研究结果表明,该酶对温度和pH均具有较宽的适应度,具有开发成生物催化剂的潜力。

基于响应面法的双向伯克霍尔德氏菌BK发酵培养基优化

为探究马尾松Pinus massoniana的伴生细菌双向伯克霍尔德氏菌BK菌株的生防潜力,优化其发酵培养基。通过单因素试验筛选得到的最佳碳源为蔗糖和麦芽糖,最佳氮源为酵母粉和胰蛋白胨,最佳无机盐为硫酸镁和柠檬酸三钠;利用Plackett-Burman试验确定3个主要影响因素分别为蔗糖、麦芽糖和装液量;通过最陡爬坡试验结合Box-Behnken设计试验及响应面分析法,以发酵液OD_(600)为响应值,优化培养基配比,获得培养基最佳配方为蔗糖8.0 g/L,麦芽糖12.5 g/L,酵母粉11.3 g/L,硫酸镁0.6 g/L,氯化钠7 g/L;最佳发酵条件为在30℃、150 r/min条件下发酵、装液量25 mL/250 mL、接菌量1%,pH7.0~7.2;根据最佳配比验证,优化后培养基的OD_(600)为1.25,较初始培养基(OD_(600)=0.62)提高1.02倍,与模型预测值相符。研究结果优化了双向伯克霍尔德氏菌BK菌株生产发酵条件,可为后续该菌的实践应用提供理论基础。

越南伯克霍尔德氏菌B418杀线虫活性产物的分离鉴定

为探寻越南伯克霍尔德氏菌B418代谢产物中的杀线虫活性物质,采用色谱分离技术和活性跟踪的方法,从越南伯克霍尔德氏菌B418代谢产物中分离鉴定出六氢-3-(异丙基)-吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮和六氢-3-(苯甲基)-吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮两种活性化合物。生物测定结果显示,两化合物在相对含量比为2.81∶1,使用浓度为20mg/mL情况下,对南方根结线虫和秀丽隐杆线虫48h校正致死率分别为60.45%和67.37%,即对南方根结线虫和秀丽隐杆线虫均有杀虫活性。

越南伯克霍尔德氏菌B418杀线虫活性产物的稳定性研究

研究越南伯克霍尔德氏菌（Burkholderia vietnamiensis）B418产生的杀线虫活性代谢产物,采用根结线虫（Meloidogyne spp.）2龄幼虫生物测定法对B418发酵液上清液的热稳定性、酸碱稳定性及有机溶剂的稳定性进行了研究。结果表明,B418代谢产物的处理温度最高不应超过60℃;pH稳定范围为7.0～10.0,其中pH为7.0时B418代谢产物活性最高,B418代谢产物处理后8 h试虫最高校正致死率为76.63%;以乙酸乙酯、石油醚、丙酮、正丁醇均降低了B418代谢产物的杀线虫活性,氯仿不影响代谢产物活性,氯仿处理后的代谢产物线虫死亡率稳定在74%以上。

越南伯克霍尔德氏菌B418培养条件的优化

以越南伯克霍尔德氏菌B418为研究对象,采用均匀设计实验、正交设计实验和单因子实验研究了各种因素对菌株生长的影响.确定了B418生长最佳培养基配方为（g· L-1）：葡萄糖10,蛋白胨5,硫酸镁2,硫酸铵3,玉米粉30,黄豆粉10,磷酸二氢钾1,磷酸氢二钾1,初始pH值7.5.主要影响因子为硫酸镁,其次为硫酸铵.其它优化培养条件包括：接种量5％、培养温度28℃、培养时间28 h、转速180 r·min-1.利用优化条件上500 L发酵罐,通气量1 ～3 L· min-1,B418在16 h进入对数生长期,28 h进入稳定期,活菌数达210.5×108 cfu·mL-1.

双向伯克霍尔德氏菌(Burkholderia ambifaria)的研究进展

双向伯克霍尔德氏菌(Burkholderia ambifaria)是伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)的一个种,广泛存在于植物根际土壤及植物体内。现有研究表明,除了个别菌株具有致病性外,大部分双向伯克霍尔德氏菌具有许多对植物和环境有益的功能,如生物修复、固氮、促生、诱导植物抗性等。近年来,双向伯克霍尔德氏菌已经在生物防治、生物促生、疫苗研制、天然产物开发等方面被广泛研究,是一种具有重要应用价值的微生物资源。本文综述了双向伯克霍尔德氏菌的研究现状,旨在为进一步应用研究提供参考。

伯克霍尔德氏菌(Burkholderia sp.)2-萘酸单加氧酶基因(nmo)的克隆及表达

通过酶切连接将Burkholderiasp.JT1 5 0 0的一段DNA片段 (4 8kb)亚克隆到表达载体pUC1 8上 ,得到重组子pEK1 2 3。测序后的pEK1 2 3重组子 4 8kb插入片段的序列已经登陆欧洲EMBL基因库 ,序列接受号为AJ5 663 3 3。对这一DNA片段的序列分析显示 ,此DNA片段含有 3个阅读框 ,且在这 3个阅读框 5′端发现一启动子特异序列。再用酶切连接方法得到仅含一个阅读框的重组子pXK3 ,其阅读框长度为 1 1 5 8bp ,编码 3 86个氨基酸 ,与已报道的RalstoniaeutrophaHF3 9羟化酶 (单加氧酶 ,bec)氨基酸序列有 64%的同源性。pEK1 2 3对 2 萘酸代谢途径中 4个关键底物的转化实验结果显示 ,其基因产物仅对 2 萘酸发生加氧转化反应 ,而且 2 萘酸浓度有明显的降低 ,证实此基因是 2 萘酸单加氧酶基因 (nmo)。同时发现其基因产物也可以转化苯甲酸钠。该酶对苯甲酸的加氧转化途径正在研究中SDS PAGE结果表明 ,pXK3、pEK1 2 3两重组子中 2 萘酸单加氧酶表达量并没明显区别 ,但加氧酶酶活却存在显著的差别。推测在启动子后 ,单加氧酶阅读框前的两个阅读框的基因产物 ,对单加氧酶活有促进作用。

基于物联网技术的湿米粉类食品中唐菖蒲伯克霍尔德氏菌风险监测研究

湿米粉作为一种深受消费者喜爱的传统食品,其生产和流通过程中易受唐菖蒲伯克霍尔德氏菌污染,引发米酵菌酸中毒事件,对公共健康构成严重威胁。本研究旨在探讨物联网技术在湿米粉类食品生产、加工、贮存及销售环节中的应用,实现对唐菖蒲伯克霍尔德氏菌风险的有效监测与控制。通过物联网技术构建实时监控系统,结合数据分析,为湿米粉类食品的安全管理提供科学依据和技术支持。

越南伯克霍尔德氏菌B418的红色荧光蛋白标记及功能稳定性

利用氨基纳米黏土介导的转化方法,应用红色荧光蛋白DsRed标记生防细菌越南伯克霍尔德氏菌Burkholderia vietnamiensis B418并研究标记菌株的功能稳定性。将带有DsRed基因的重组质粒pGEX-4T-1-DsRed转化导入B418菌株中,采用细菌培养法、继代培养法和平板对峙培养法检测标记菌株的功能稳定性。通过氨基纳米黏土转化体系成功获得了荧光标记菌株B418-DsRed,与野生菌株B418相比,其生长曲线和形态学特征基本一致。继代培养10代后,标记菌株在共聚焦显微镜下呈现亮红色荧光,能够提取到外源质粒pGEX-4T-1-DsRed,并通过聚合酶链式反应扩增获得荧光基因序列DsRed,证明标记菌株具有较好的遗传稳定性。平板对峙培养试验显示,标记菌株B418-DsRed对尖孢镰孢菌和大丽轮枝菌抑制率分别为55.25%和67.55%,与野生菌株B418无显著性差异,表明外源质粒的导入未影响菌株的抑菌能力。以上结果表明通过氨基纳米黏土介导成功实现了伯克霍尔德氏菌B418的红色荧光蛋白标记,构建的标记菌株B418-DsRed可用于该生防菌在植物根际的定殖及与病原菌的互作研究。

吡咯伯克霍尔德氏菌JK-SH007对杨树根际微生物数量及功能多样性的影响

【目的】为揭示生防菌吡咯伯克霍尔德氏菌JK-SH007进入自然环境后对周围的微生态因子是否存在威胁,对其进入自然环境后的微生态效应和生物安全性做出正确评估。【方法】采用固体平板法研究JK-SH007菌株对美洲黑杨盆栽苗土壤微生物种群数量的影响,对4种主要土壤酶(酸性磷酸酶、碱性磷酸酶、脱氢酶、转化酶)的活力进行测定,并通过Biolog ECO微孔板法分析JK-SH007菌株对美洲黑杨土壤功能多样性的影响。【结果】从整体趋势来看,在美洲黑杨根际引入JK-SH007菌株后,随着时间延长,根际土壤中的细菌、放线菌、真菌数量逐渐高于对照,且差异显著,在接种后150天接种处理达到峰值(3.36×109cfu·g^(-1)干土;7.50×107cfu·g^(-1)干土;1.14×107cfu·g^(-1)干土),随后显著降低,但仍优于未接种处理;JK-SH007处理后土壤酶活性均有所增强,土壤酸性磷酸酶、碱性磷酸酶、脱氢酶、转化酶活性均大于对照,其中,接种对碱性磷酸酶、转化酶活性的促进最为明显;根际土壤中微生物的AWCD值(除了在接种后30,90天时),接种处理和未接种处理的AWCD值相当,几乎持平;而接种后10,20,60,120,150,180天时接种处理土样微生物的AWCD值均高于CK;土壤微生物多样性(Shannon指数、Simpson指数和Mc Intosh指数)在接种前期没有明显的规律性,与对照几乎持平,120,150,180天时,接种JK-SH007处理的Simpson指数、Shannon指数、Mc Intosh指数均高于对照,但差异不显著。【结论】在根际引入JK-SH007对美洲黑杨根际土壤微生物的整体活性和功能多样性的提高有一定的促进作用,在一定程度上丰富了土壤微生物种群,有利于保持和促进土壤肥力和健康状况,但这些影响随着时间的延长而减弱;同时也说明JK-SH007菌株的施入不会对环境中土著微生物构成威胁或威胁较小,符合Bcc菌的安全应用范围,进一步证明该菌株的生物安全性,为将来该菌株的野外应用及生防菌剂的开发奠定基础。

洋葱伯克霍尔德氏菌及其在林木病害防治中的应用

洋葱伯克霍尔德氏菌是一个具有17个相近种的复合群体,称为洋葱伯克霍尔德氏菌群(Burkholderia cepacia complex,简称BCC),其中一些种具有生物防治、促进植物生长、生物修复等功能,同时又有一些种是人类的条件致病菌。笔者就BCC的生物学特性、基因型和基因组、生防机制、安全性评估、在林业中的应用现状等进行综述,同时对其在我国林业中应用前景进行了分析,认为正确区分有毒株和无毒株是BCC在林业中应用的关键和前提,最后提出了在林业中应用BCC菌株要注意的8个方面。

吡咯伯克霍尔德氏菌JK-SH007的发酵条件及其对杨树溃疡病的防治效果

本文研究了拮抗细菌吡咯伯克霍尔德氏菌Burkholderia pyrrocinia菌株JK-SH007产抗菌物质的最佳发酵条件及其对杨树溃疡病的野外防治效果。结果表明,牛肉膏、蛋白胨是发酵培养基中最佳营养物质,有利于菌株JK-SH007抗菌物质的产生;培养基初始pH、培养时间、温度、培养体积、不同牛肉膏、蛋白胨组合等对菌株生长及其抗菌物质的产生有明显的影响,初始pH7、牛肉膏2g、蛋白胨20g、以1/2装液量装液、30℃振荡培养36h可获得较高产量的胞外分泌型抗菌物质;菌株JK-SH007的发酵液对杨树溃疡病的野外防效可达40.54%。

洋葱伯克霍尔德氏菌株Lyc2的鉴定及对棉苗的防病促生作用

从烟草根际土壤中分离到一株细菌菌株Lyc2,平皿对峙培养显示该菌可显著抑制多种植物病原真菌菌丝体的生长。温室盆栽试验表明,Lyc2对棉花苗期立枯病的防治效果达到48.8%;水培棉花苗试验表明,Lyc2能显著增加棉苗的鲜重和干重,但对株高的影响不显著。该菌经形态、生理生化试验测定及16S rDNA和ITS序列分析,初步确定为洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia);进一步通过种特异的recA基因序列分析,证明Lyc2菌株属于B. cepacia复合物中基因型IX,B.pyrrocinia。

多噬伯克霍尔德氏菌WS-FJ9对草甘膦的降解特性

长期或不当施用草甘膦会对非靶标生物和环境造成破坏作用。微生物是生物修复的重要生物资源,利用微生物及其产生的降解酶处理环境中有机磷农药的方法,已显示出良好的应用前景,是近年来研究有机磷农药降解的主要发展方向。研究分离松树根际土壤的高效解磷细菌多噬伯克霍尔德氏菌(Burkholderia multivorans)WS-FJ9菌株对草甘膦的降解特性及其降解条件的优化。采用添加不同浓度草甘膦NA平板接种WS-FJ9菌株观察其对草甘膦的耐受性;分别以草甘膦为唯一碳源、氮源或磷源,探讨WS-FJ9菌株对草甘膦的利用状况;采用低进水量间歇式反应器法(FBR)测定了WS-FJ9菌株降解草甘膦动力学参数;利用Plackett-Burman(PB)、Central Composite Design(CCD)试验设计及响应面分析法(RSM)筛选与优化影响WS-FJ9菌株降解草甘膦的主要因素。WS-FJ9菌株有效降解草甘膦的最大耐受浓度为0.4%;WS-FJ9菌株在以草甘膦为唯一碳源、氮源或磷源培养基上均能正常生长;WS-FJ9菌株对草甘膦的亲和性常数(K s值)为65μL/mL,对草甘膦降解的极限浓度(S min)为21.9μL/mL;通过PB试验,筛选出3个影响菌株降解草甘膦的关键因素为培养温度、葡萄糖及硫酸铵的加入量,通过CCD设计及响应面法优化分析得到影响草甘膦降解率的关键因素的二阶模型,确定了WS-FJ9菌株降解草甘膦的最优实验操作条件为:培养温度27.7℃,葡萄糖和硫酸铵的加入量分别为0.67、0.50 g/L。实验条件下WS-FJ9菌株对草甘膦的降解率最高为72.83%。

洋葱伯克霍尔德氏菌Lu10-1产生抗菌活性物质的发酵培养基和发酵条件优化

洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)Lu10-1是从桑叶中分离得到的一株具有抗菌及促进植物生长等多种生物学功能的内生细菌。利用基于统计学的响应面法(response surface methodology,RSM)对影响该菌产生抗细菌活性物质的发酵培养基组成和发酵培养条件进行了优化。部分重复因子试验表明,酵母浸粉和氯化钠是培养基组分中的主要影响因子,其中酵母浸粉为正效应,氯化钠为负影响;结合最陡爬坡路径逼近最大响应区域和中心组合设计及响应面分析,确定了培养基中主要配方的最佳质量浓度为蔗糖17.0 g/L、酵母浸粉5.855 g/L、氯化钠4.519 g/L、磷酸二氢钾0.2 g/L。通过PB(plackeet-burman)试验发现接种量和发酵温度是该菌株产生抗菌活性物质发酵条件中的主要影响因子,经中心组合设计法优化的最佳发酵条件为:接种量0.027 7 mL/mL,摇瓶装液量100 mL,发酵温度30.29℃,培养基初始pH6.2,培养时间42 h。

洋葱伯克霍尔德氏菌Lu10-1产脂肪酶发酵条件优化及酶学性质研究

旨在对洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)Lu10-1产脂肪酶的发酵条件及酶学性质进行研究。通过单因素和正交实验探讨了碳源、氮源、诱导物、初始p H值、温度等主要发酵参数的影响,并初步考察了温度、p H、金属离子和有机溶剂等对其催化反应的影响。结果表明,B.cepacia Lu10-1产脂肪酶最佳培养基组成和发酵参数为:可溶性淀粉1.5%,蛋白胨1.5%,橄榄油3 g/L,K2HPO4 2 g/L,发酵温度32℃,初始p H 9.0,培养48 h酶活达12.4 U/m L,比初始酶活提高了2.7倍。酶的最适温度和p H值分别为60℃和9,在60℃以下保持100 h酶活仍保持在80%以上,在p H5.0-10.0之间活性稳定,对甲醇、乙醇等有机溶剂耐受性好。