越桔叶有效成分熊果甙的变化动态

用高效液相色谱法分析了大兴安岭不同地区、不同季节采收的越桔叶中的熊果甙。结果表明:含量因季节和地区而变化;不同产地均以果实成熟后含量最高。

樟叶越桔叶芽总RNA提取方法比较研究

本项实验采用改良CTAB、改良SDS、RNApure Plant Kit和Plant RNA Kit 4种方法提取樟叶越桔叶芽总RNA,以期获得适合于樟叶越桔叶芽高质量总RNA的最佳提取方法。总RNA纯度和完整性分别用紫外分光光度计法和琼脂糖凝胶电泳法检测。结果表明,采用改良CTAB和Plant RNA Kit法获得的RNA完整性好,纯度高,A260/A280值分别为2.07和2.08,28S和18S rRNA条带清晰,且前者的亮度约为后者的2倍,无弥散现象。将改良CTAB和Plant RNA Kit法获得的总RNA进行RT-PCR扩增,成功克隆获得了樟叶越桔花色苷5-芳香族酰基转移酶基因长316 bp的cDNA序列。证明改良CTAB和Plant RNA Kit法是樟叶越桔叶芽高质量总RNA的最适提取方法。

樟叶越桔叶2个新6-O-咖啡酰葡萄糖苷的分离鉴定

为进一步挖掘樟叶越桔叶中的化学成分,采用硅胶、葡聚糖凝胶LH−20、Diaion HP20等多种柱层析方法,从其叶的80%甲醇提取物中分离得到2个新的6−O−咖啡酰葡萄糖苷,分别命名为樟叶越桔苷K(dunalianoside K,1)和樟叶越桔苷L(dunalianoside L,2),它们的化学结构通过HRMS、^(1)H NMR、^(13)C NMR、HSQC、HMBC和COSY等波谱分析得到确定。

樟叶越桔叶内生真菌的抑菌活性研究

为筛选具有抑菌活性的樟叶越桔叶内生真菌,以小麦雪腐病菌等10种植物病原真菌作为靶标菌,采用平板对峙法和生长速率法测定内生真菌的拮抗效果及其代谢产物的抑菌活性。结果表明:有10株内生真菌分别对小麦雪腐病菌、三七丝核病菌、番茄灰霉病菌、辣椒镰刀病菌和白菜黑斑病菌具有较强的抑菌活性,其中烟曲霉菌株的抗菌活性最强,对番茄灰霉病菌、辣椒镰刀病菌和三七丝核病菌的抑菌率分别为83.26%、68.82%和68.57%。

樟叶越桔肌动蛋白Actin7基因克隆与组织表达

【目的】研究樟叶越桔肌动蛋白Actin7基因的组织表达特征。【方法】在樟叶越桔三代转录组数据库的基础上,应用PCR技术成功克隆VdActin7基因cDNA和DNA序列。进一步利用qRT-PCR技术检测并分析VdActin7基因在樟叶越桔幼嫩叶片、成熟叶片、花芽、花、绿色果实、红色果实、绿色果梗和红色果梗等组织中的表达情况。【结果】获得VdActin7基因DNA序列1657 bp, cDNA序列1387 bp。VdActin7基因含有3个内含子,分别为93 bp的intron1、89 bp的intron2和88 bp的intron3,完整开放阅读框长1134 bp,编码377个氨基酸,理论分子量为41.70 KD,等电点为5.31,无信号肽和跨膜结构,属于稳定亲水性蛋白。系统进化树分析发现,VdActin7蛋白与同为越橘属的兔眼越橘(Vaccinium ashei)Actin7亲缘关系最近。VdActin7基因密码子偏好性分析显示,总GC含量和同义密码子第三位核苷酸含量(GC3s)分别为48.2%和44.1%,有效密码子数(ENC)为49.28%,高频密码子共有31个。VdActin7与枣树(Ziziphus jujuba)ZjActin7基因相似,均对CUU偏好性最强,GUU次之,但VdActin对CUU的偏好性(3.43)明显强于ZjActin7(2.57)。qRT-PCR结果显示,VdActin7基因表达呈现明显的组织特异性,在嫩叶中高表达,在成熟叶和果梗中表达量较低,而在果实中检测不到表达量或不表达,暗示VdActin7基因可能在嫩叶的发育过程中发挥重要作用。【结论】本文首次报道了樟叶越桔Actin7基因序列及序列特征,并发现VdActin7基因具有组织表达特异性,为进一步研究VdActin7基因功能、表达调控及作用机制奠定了基础。

樟叶越桔60S核糖体蛋白L9基因的克隆及生物信息学分析

【目的】克隆樟叶越桔稳定内参基因60S核糖体蛋白L9基因全长cDNA和基因组DNA序列,并分析其序列特征及密码子偏好性,为樟叶越桔中其他功能基因研究与遗传工程操作提供参考。【方法】在樟叶越桔三代转录组数据库的基础上,筛选60S核糖体蛋白L9基因cDNA序列并设计特异性引物,以樟叶越桔嫩叶总RNA和总DNA分别为模板,应用PCR技术扩增目的基因全长cDNA和基因组DNA序列,并克隆、测序、进行序列分析。同时使用EMBOSS、Codon W软件分析目的基因的碱基含量、密码子适应指数(CAI)、相对密码子使用度(RSCU)、同义密码子第三位核苷酸的GC含量(GCS3)、有效密码子数(ENC)。【结果】克隆获得樟叶越桔60S核糖体蛋白L9基因666 bp cDNA序列(NCBI:ON637115)和2224 bp基因组DNA序列(NCBI:ON584188),将该基因命名为VdRPL9。VdRPL9基因含有2个内含子,分别为1616 bp的intron1、144 bp的intron2。VdRPL9基因转录的mRNA分子中完整开放阅读框长585 bp,其翻译编码194个氨基酸残基构成VdRPL9蛋白。从动物、植物和真菌RPL9蛋白高同源性特点推测不同生物界的RPL9基因在进化上极度保守,具有共同的祖先。相比于RSCU聚类树,RPL9蛋白序列系统进化树更能真实展现物种之间的系统发育关系。VdRPL9基因偏好性强的密码子(RSCU>1)共有25个、且多以CG结尾,CAI和ENC的值分别为0.29和51.8,故推测该基因表达水平偏低。【结论】本研究首次报道了樟叶越桔中内参基因VdRPL9基因序列及序列特征,并分析了VdRPL9基因的密码子特征。这为进一步研究VdRPL9基因功能、优化改造VdRPL9基因的密码子,提高其在樟叶越桔中的表达水平,探究其表达调控及作用机制奠定了基础。

樟叶越桔糖基转移酶VdUGT1基因克隆及序列分析

根据樟叶越桔Vaccinium dunalianum叶芽转录组测序实验获得的糖基转移酶Vd UGT1基因部分c DNA序列设计引物,采用RACE-PCR技术克隆了全长1 620 bp c DNA序列的Vd UGT1基因,包括1 398 bp c DNA序列的完整开放阅读框,推测编码由465个氨基酸残基组成、相对分子质量为50.89 k D的糖基转移酶Vd UGT1。序列分析表明,Vd UGT1理论等电点为5.53,负电荷残基(Asp+Glu)总数为53个,正电荷残基(Arg+Lys)总数为41个,不稳定系数为48.38,属于不稳定蛋白;其二级结构的主要构件为α-螺旋和随机卷曲,无跨膜结构域,属于亲水性蛋白质。Vd UGT1位于C末端含有尿嘧啶核苷二磷酸糖基转移酶所特有UDPGT功能域,推测与尿嘧啶核苷二磷酸糖的结合有关。该研究为后期Vd UGT1的异源表达和功能研究奠定了基础。

樟叶越桔(原变种)新鲜叶芽挥发性成分的GC-MS分析

采用水蒸气蒸馏法结合气相色谱-质谱联用技术,对樟叶越桔(原变种)新鲜叶芽的挥发性成分进行分析。共分离出44种挥发性成分,鉴定其中27种成分的组成,包括8种醇类、5种烷烃类、5种酯类、3种烯烃类、2种酸类、2种醛类、1种酮类及1种吡喃类。其中二甲基十氢化萘的含量最高(47.035%),其他含量较高的有芳樟醇(3.185%)、3,7-二甲基-1,5,7-辛三烯-3-醇(1.398%)和苯乙醛(1.034%)。

樟叶越桔VdARP7基因片段克隆与表达分析

基于樟叶越桔叶芽转录组测序数据,筛选获得ARP7基因cDNA片段,采用RACE-PCR技术克隆了樟叶越桔VdARP7基因cDNA序列,并应用半定量PCR技术分析了VdARP7基因在樟叶越桔不同组织中的表达特征。结果表明:克隆了VdARP7基因964 bp cDNA片段,包括3'UTR完整区域和Poly A尾巴特征,VdARP7属于Actin超级家族ARPs亚家族基因新成员,与多种高等植物已知ARP7基因具有较高的同源性,推导编码VdARP7蛋白的C-末端225个氨基酸残基序列,含1个NBD_sugar-kinase_HSP70_actin保守结构域。VdARP7基因能在樟叶越桔叶芽、嫩叶、老叶、花芽和花等组织中稳定表达,推测ARP7作为组成型表达的蛋白质在植物生长和发育等过程中发挥重要生理功能。

樟叶越桔ITS序列及6’-O-咖啡酰熊果苷含量分析

2012年首次对杜鹃花科越桔属植物樟叶越桔原变种6’-O-咖啡酰熊果苷高产株的内转录间隔区(ITS)序列进行了PCR扩增和序列测定。通过BLAST同源搜索,采用邻位相连法构建了与其亲缘关系接近的越桔属8个种(或变种)的系统发育树,并分析了它们的亲缘关系。结果表明,参试材料与GenBank登记的长尾叶越桔(变种)和樟叶越桔ITS序列的同源性高达99%,显然属于种内变异水平。参试样本与长尾叶越桔(变种)和樟叶越桔的亲缘关系较近,遗传距离分别为0.008和0.010。研究结果将为寻找6’-O-咖啡酰熊果苷高产性状的近缘替代资源提供参考。

樟叶越桔甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因VdGAPDH1的cDNA克隆与序列分析

应用转录组测序分析和RT-PCR技术首次从樟叶越桔Vaccinium dunalianum中克隆了全长1 570 bp的甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因Vd GAPDH1,其完整的开放阅读框推测编码由337个氨基酸残基组成的Vd GAPDH1。Vd GAPDH1理论相对分子量为36.57 k D,等电点为7.06,负电荷残基(Asp+Glu)总数为42个,正电荷残基(Arg+Lys)总数为42个,不稳定系数为23.27,属稳定性蛋白质;其二级结构主要由随机卷曲、延伸链、α-螺旋和β-转角等构件组成。Vd GAPDH1为无信号肽、无跨膜结构的亲水性蛋白质,推测其为NAD+-GAPDH的新成员,与已知细胞质型GAPDH之间存在高度保守性。Vd GAPDH1包含2个保守超家族结构域Gp_dh_N和Gp_dh_C,Gp_dh_N为辅酶NAD+结合结构域,Gp_dh_C是行使糖运输和代谢的催化功能域。推测Vd GAPDH1基因产物在樟叶越桔细胞质中参与糖酵解过程。该研究为后期Vd GAPDH1基因的生理功能及其表达调控等研究奠定了基础。

樟叶越桔幼茎愈伤组织诱导和不定根的再生

【目的】建立樟叶越桔遗传转化体系,并为其重要次生代谢产物熊果苷及其衍生物的生产提供材料参考。【方法】以樟叶越桔组培苗幼嫩茎段为外植体,采用木本植物培养基(WPM)培养,研究不同质量浓度的2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)和噻苯隆(TDZ)搭配对樟叶越桔茎段愈伤组织的诱导,并分析不同细胞分裂素及其质量浓度对愈伤组织再分化不定根的影响,获得樟叶越桔茎段愈伤组织诱导和愈伤组织再分化不定根的理想配方。【结果】樟叶越桔茎段愈伤组织诱导最佳培养基配方为WPM+2,4-D 2.0 mg/L+TDZ 0.1 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂5 g/L,诱导出的愈伤组织呈乳白色且质地紧实,诱导率可达100%。樟叶越桔愈伤组织再分化不定根的最佳配方为WPM+TDZ 0.5 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂5 g/L,不定根生根率高达96.7%,数量多、较长、整齐且均匀。【结论】成功建立了樟叶越桔幼嫩茎段愈伤组织诱导及愈伤组织再分化不定根的体系,对以愈伤组织和不定根为材料的樟叶越桔重要次生代谢产物的生产具有一定的参考意义。

樟叶越桔热激蛋白基因对温度胁迫的响应表达

【目的】分析樟叶越桔热激蛋白基因响应不同温度变化的表达模式,为阐明热激蛋白在樟叶越桔响应温度胁迫过程中的生物学功能奠定理论基础。【方法】以樟叶越桔成熟叶片为材料,从建成的转录组数据库中筛选出候选内参基因(VdARP、VdGAPDH和VdEF-1α)和热激蛋白基因(VdHSP90、VdHSP70和VdsHSP)的cDNA序列,利用RT-qPCR技术检测目的基因在不同温度(4、25和35℃)、不同时间(1、5、10和15 d)处理下的表达情况。应用软件BestKeeper、GeNorm、Normfinder和RefFinder综合分析3个候选内参基因的表达稳定性,以表达最稳定的内参基因作为参照,分析3个热激蛋白功能基因响应不同温度的表达模式。【结果】软件BestKeeper、GeNorm、Normfinder和RefFinder综合分析显示,3个候选内参基因表达稳定性为VdARP>VdGAPDH>VdEF-1α,因此以VdARP为内参基因分析热激蛋白基因的表达情况。试验中3个热激蛋白基因在25℃各时间处理组中的表达水平整体趋于稳定。4℃和35℃处理均能诱导樟叶越桔VdHSP90和VdHSP70基因在一定时间内表达水平显著增加,但VdHSP90和VdHSP70基因受4℃诱导表达的水平分别显著高于35℃。VdsHSP基因受35℃高温诱导后显著上调表达,但显著受到4℃低温的抑制而下调表达。【结论】3个热激蛋白基因VdHSP90、VdHSP70和VdsHSP在不同温度(4、25和35℃)处理的樟叶越桔叶片中均有表达,其表达水平显著受到高、低温胁迫的影响。VdHSP90和VdHSP70基因表达在高、低温度胁迫下均显著上调,且对低温胁迫的响应更显著;而VdsHSP基因仅在高温度胁迫下显著上调表达。显示HSP90和HSP70基因表达产物在樟叶越桔抵御零上低温胁迫过程发挥重要功能,而sHSP基因表达产物则主要参与了樟叶越桔对高温胁迫的响应过程。

樟叶越桔不定根培养体系建立

以樟叶越桔组培苗叶片为试验材料,分析不同暗培养时间、激素、碳源以及培养基等因素对不定根诱导的影响,建立了樟叶越桔叶片诱导不定根的培养体系,并进一步采用正交试验设计筛选出樟叶越桔叶片直接诱导不定根的最优诱导方案。结果表明:WPM+IBA 1.0 mg/L+50.0g/L白砂糖+暗培养15 d为不定根的最适诱导条件,其生根率达96.7%。

樟叶越桔1株内生真菌的鉴定及其抑菌活性

从野生樟叶越桔叶中分离得到1株内生真菌VDL117,利用形态学分类方法、ITS序列测定以及系统发育分析鉴定其为曲霉属杂色曲霉。采用生长速率法测定了其发酵液对棉花枯萎菌等5种常见农作物病原真菌的抑菌活性,并对其发酵液进行了酸碱稳定性及热稳定性实验。结果表明:VDL117发酵液对5种病原真菌均有一定的抑制作用,发酵液在酸性条件下对5种病原真菌的抑制活性较强,碱性条件下活性减弱,并在70℃及以下温度能保持活性稳定。

樟叶越桔组培苗生根和移栽技术研究

为解决樟叶越桔(Vacciniumdunalianum)组培苗生根质量不佳、移栽成活率低的问题,该研究以樟叶越桔继代苗为材料,采用单因子试验从激素类型及浓度、培养基类型和蔗糖质量浓度对其生根的适宜条件进行筛选,进一步研究了不同基质配比对樟叶越桔移栽苗存活率的影响。结果表明:激素类型和浓度、培养基类型对樟叶越桔生根率的影响最大,其次为蔗糖质量浓度;最适合樟叶越桔生根的激素及浓度为IBA2.0mg·L-1、基本培养基类型为1/4MS、蔗糖质量浓度为15g·L^-1,樟叶越桔组培苗最佳生根培养基为1/4MS+IBA2.0mg·L^-1+活性炭0.1g·L^-1+蔗糖15g·L^-1,生根率达100%,平均生根数为每株7.67条;根系呈辐射状、基部无愈伤组织,组培苗生长健壮、叶色浓绿;樟叶越桔组培苗移栽时以全腐殖土基质为佳,成活率为83.7%,植株叶片舒展,生长状况良好。该研究建立的优化体系有效地提高了樟叶越桔组培生根苗的生根率和生根质量,解决了后期移栽成活困难的问题,为优良的樟叶越桔植株规模化生产提供了科学依据和技术支持。

樟叶越桔嫩枝内生真菌的植物病原菌拮抗活性

【目的】筛选具有病原菌拮抗活性的樟叶越桔嫩枝内生真菌,为活性内生真菌的进一步开发利用提供参考。【方法】以禾谷镰孢Fusarium graminearum等5种病原真菌和密粘褶菌Gloeophyllum trabeum等3种木腐菌为指示菌,采用平板对峙法测定内生真菌的拮抗活性。【结果】有7株内生真菌对绵腐卧孔菌Poria placenta呈现强拮抗作用,其中拮抗最强的是季也蒙毕赤酵母(Meyerozyma guilliermondii,VDBF-18),抑菌率高达88.9%,其次是Neofusicoccum vitifusiforme(VDBF-25)、Pezicula heterochroma(VDBF-13)、Helotiales sp.(VDBF-16)、胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides,VDBF-23)、Diaporthe nobilis(VDBF-11)和D.rudis(VDBF-37),抑菌率分别为87.5%、84.5%、80.9%、78.4%、76.9%和75.3%。Pezicula neosporulosa(VDBF-2)和VDBF-25对采绒革盖菌呈现强拮抗作用,抑菌率分别为77.0%和76.3%,层出盘菌属Proliferodiscus sp.菌株VDBF-6和Xylaria venosula(VDBF-27)对密粘褶菌呈现强拮抗作用,抑菌率分别为81.1%和76.2%。有14株内生真菌对5种病原真菌均呈现较强及以上拮抗能力,其中VDBF-2对芸苔链格孢Alternaria brassicicola,VDBF-11和Cytospora sp.(VDBF-42)对禾谷镰孢,VDBF-18对灰葡萄孢Botrytis cinerea,白座蕉孢壳(Diatrype stigma,VDBF-14)对尖孢镰孢F.oxysporum,VDBF-37对腐皮镰孢F.solani呈现强拮抗能力,抑菌率分别为81.0%、76.7%、77.8%、82.8%、75.3%和75.2%。VDBF-6菌株对腐皮镰孢和尖孢镰孢显示无拮抗作用,但对禾谷镰孢和灰葡萄孢的拮抗作用最强,抑菌率分别高达90.8%和83.3%。【结论】供试20株樟叶越桔嫩枝内生真菌对3种木腐菌和5种植物病原真菌均具有较强的拮抗活性。

樟叶越桔愈伤组织诱导及其细胞悬浮培养体系建立

以樟叶越桔组培苗幼嫩叶片为外植体,研究了植物生长调节剂对其愈伤组织诱导和增殖的影响,建立樟叶越桔的细胞悬浮培养体系。结果表明,樟叶越桔的愈伤组织诱导的适宜培养基为WPM+2.0mg/L6-BA+0.05mg/LNAA+2.0mg/L2,4-D+30%蔗糖。樟叶越桔愈伤组织增殖的最佳植物生长调节剂组合为2.0mg/LZT+0.4mg/LNAA,得到的蓬松愈伤组织适宜进行其悬浮培养。WPM3/5有机为适宜的改良培养基,通过细胞悬浮生长曲线的测定,确定樟叶越桔细胞悬浮培养较适宜的继代周期为14d,最长不宜超过21d。