趋化因子CCL28基因的克隆表达及其多抗制备

将原核表达质粒pGEX-6P-1-CCL28转化至大肠埃希菌BL21中,经IPTG诱导,获得了GST-CCL28可溶性融合表达产物。利用纯化的GST-CCL28蛋白免疫BALB/c小鼠制备了抗GST-CCL28的多克隆抗体。同时将CCL28基因亚克隆进真核表达载体,经测序验证后命名为pcDNA3.1-CCL28。间接免疫荧光及Western blot试验结果进一步证明,所获得的抗GST-CCL28多克隆抗体能特异性的识别转染pcDNA3.1-CCL28质粒的DF-1细胞内高表达的CCL28蛋白。这一研究为制备抗CCL28单克隆抗体和探究与CCL28相关的生物学功能及其机制奠定了良好的基础。

CCL27 CCL28及CCR10在癫痫小鼠急性期表达增高

目的探讨趋化因子CCL27、CCL28及其受体CCR10在小鼠癫痫急性期外周血中的表达变化。方法取正常及癫痫小鼠急性期不同时间点(10min、30min、1h、2h)外周血利用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)法检测毛果云香碱致癫痫发作小鼠急性期外周血中CCL27、CCL28mRNA水平;同期取正常及癫痫急性期不同时间点(10min、30min、1h、2h)肝素抗凝外周血,提取淋巴细胞层后利用FACSsort型流式细胞仪检测外周血淋巴细胞CCR10蛋白水平的表达变化。结果癫痫小鼠发作急性期外周血中CCL27、CCL28mRNA水平、淋巴细胞中CCR10蛋白表达水平均在癫痫发作2h高于对照组(P<0.05)。结论癫痫发作早期已出现外周血免疫功能紊乱,该病理变化可能与癫痫发病过程中的炎性反应和神经细胞的凋亡相关。

缺氧微环境中CCL28高表达促进HCCLM3细胞迁移和侵袭

目的探讨缺氧条件下HCCLM3细胞趋化因子CCL28表达情况及作用。方法实时定量PCR和ELISA方法检测缺氧条件下肝癌细胞HCCLM3趋化因子CCL28表达水平;运用小干扰RNA(small interferingRNA,siRNA)和Lipofectamine 2 000细胞转染技术下调CCL28表达;用Transwell和Matrigel观察肝癌细胞HCCLM3侵袭迁移情况;采用明胶酶谱法测定CCL28-siRNA干扰后细胞上清中的基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinase enzyme,MMP)含量。应用实时定量PCR检测50例肝细胞癌组织中CCL28mRNA表达情况,运用卡方检验和Kaplan-Meier法分析CCL28表达与临床病例特征及患者总体生存时间的关系。结果肝癌HCCLM3细胞内CCL28mRNA在缺氧培养6h后表达增高,蛋白水平在缺氧培养12h后表达增高,呈时间依赖性。SiRNA抑制CCL28表达后,缺氧条件下HCCLM3细胞迁移数目(65.2±4.49)较siRNA阴性组(85±5.91)和空白组(87.4±8.44)有所减少(P<0.001);穿过Matrigel膜细胞数目(43.2±5.36)较siRNA阴性组(58±3.87)和对照组(54.6±9.53)有所减少(P=0.011)。明胶酶谱法发现CCL28表达抑制后HCCLM3分泌MMP-2减少。PCR结果提示,肝癌组织CCL28mRNA表达量为0.0254±0.0755,与正常肝组织相比,23例(46%)呈高表达,CCL28表达高低与肿瘤最大径(P=0.027)、术后复发相关(P=0.019);CCL28高表达与低表达组之间总体生存无明显差异(χ2=0.008,P=0.927)。结论缺氧条件下趋化因子CCL28高表达并参与肝癌细胞HCCLM3迁移侵袭过程。肝癌组织中CCL28表达增高与术后复发相关。

CCL28-CCR10通路在类风湿关节炎单核细胞迁移中的作用

目的:观察类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)患者关节中单核/巨噬细胞趋化因子受体CCR10的表达,探讨趋化因子CCL28与其受体CCR10在RA单核细胞迁移中的作用及机制。方法:采用免疫组织化学法分析8例RA患者、4例骨关节炎(osteoarthritis,OA)患者和4例正常对照者滑膜组织中CCR10的表达并进行细胞染色评分(0~5分),流式细胞术检测26例RA患者和20例健康对照者外周血、15例RA患者滑液CD14^(+)单核细胞中CCR10阳性细胞比例,Transwell迁移实验检测CCL28对RA和健康对照单核细胞的趋化性,Western blotting检测CCL28干预RA单核细胞的细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)、蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)通路磷酸化。结果:CCR10表达在RA滑膜衬里层细胞及衬里下层的巨噬细胞、血管内皮细胞、淋巴细胞;RA滑膜衬里层细胞和衬里下层巨噬细胞的CCR10表达明显高于OA和正常对照的滑膜(P均<0.01)。RA患者外周血CD14^(+)单核细胞表达CCR10明显高于健康对照者[(15.6±3.0)%vs.(7.7±3.8)%,P<0.01];RA患者滑液单核细胞CCR10的表达为(32.0±15.0)%,明显高于RA外周血(P<0.01)。体外实验中,10~100μg/L的CCL28能有效诱导RA和健康对照外周血CD14^(+)单核细胞迁移(P均<0.01);抗CCR10单抗能明显抑制CCL28对RA单核细胞的趋化(P<0.01)。CCL28干预RA单核细胞明显增加ERK和Akt的磷酸化(P均<0.05);ERK抑制剂(U0126)、磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)抑制剂(LY294002)可明显降低CCL28诱导的RA单核细胞迁移(P均<0.01)。结论:RA患者外周血、滑液及滑膜单核/巨噬细胞CCR10表达增高,CCL28与CCR10结合并通过激活ERK、PI3K/Akt信号通路促使RA单核细胞迁移;CCL28-CCR10通路可能参与招募单核细胞进入RA关节,从而促进滑膜炎症和骨破坏。