企鹅珍珠贝足丝蛋白3基因的克隆及其表达分析

为探明企鹅珍珠贝足丝黏附的分子机理,基于企鹅珍珠贝转录组序列,应用RACE-PCR技术获得足丝蛋白3(BP3)基因的cDNA全长序列,通过实时荧光定量PCR技术分析BP3基因在有足丝企鹅珍珠贝各组织及有/无足丝个体足中的表达情况。结果显示,企鹅珍珠贝BP3基因cDNA全长为601 bp,开放阅读框长453 bp,共编码150个氨基酸,该基因5′端非编码区为71 bp, 3′端非编码区为77 bp。蛋白质分子质量为16.81 ku,等电点为7.33,是一种亲水性稳定膜外蛋白,主要定位于细胞外基质。氨基酸序列比对表明,企鹅珍珠贝足丝蛋白3与厚壳贻贝同源性最高,为30.34%。实时荧光定量PCR结果显示,各组织中均有BP3基因mRNA表达,表达量在外套膜组织中最高,与足、闭壳肌、珍珠状袋存在显著差异(P<0.05),而与鳃、唇瓣差异不显著(P>0.05),且在有足丝企鹅珍珠贝个体足中的表达量显著高于无足丝个体足(P<0.05)。本试验结果可为进一步探究企鹅珍珠贝足丝黏附的分子机理提供基础。

厚壳贻贝(Mytilus coruscus)足丝蛋白mcofp3和mcofp6的cDNA克隆及序列分析

通过设计特异性引物,采用PCR扩增的方法对厚壳贻贝足腺细胞cDNA文库进行筛选,共克隆得到14条厚壳贻贝mcofp3的cDNA序列和8条mcofp6的cDNA序列,并对其基因序列及推导的氨基酸序列进行了序列比对和变异位点初步分析。结果表明,14条mcofp3cDNA序列分属于厚壳贻贝mcofp3家族的两个亚家族,其成熟肽序列变异相对活跃;而8条mcofp6 cDNA序列并无明显的亚家族划分,序列相对保守。本次实验所获得的mcofp cDNA序列初步显示了厚壳贻贝足丝蛋白家族基因的分子多样性,为将来深入了解厚壳贻贝足丝蛋白的分子多样性机制以及在此基础上开发相关的新型生物黏附剂奠定了基础。

利用蛋白质组学手段鉴定新型贻贝足丝蛋白

贻贝通过足腺分泌特有的足丝并以此粘附于水下各种基质表面.贻贝足丝中富含各种粘附蛋白,其优异的水下粘附性能使其成为开发新型生物粘合剂的候选分子.厚壳贻贝足丝粘附能力强,本文采用尿素及盐酸胍抽提结合二维双向电泳技术(two-dimensional electrophoresis,2-DE),分别对厚壳贻贝足丝纤维和足丝盘的蛋白质进行分离及染色;采用串联质谱技术结合常规搜库和表达序列标签(EST)数据库搜索,对分离获得的蛋白质点进行鉴定,从中获得了mfp-3、mfp-6、胶原蛋白以及3种未曾报道过的新型贻贝足丝蛋白成分.上述研究为深入了解厚壳贻贝足丝蛋白的分子多样性、探讨其粘附机理以及从中筛选具有应用前景的贻贝足丝蛋白奠定了基础.

厚壳贻贝低分子量足丝蛋白的初步鉴定(英文)

足丝蛋白是贻贝科(Mytilidae)所特有一种在水环境中也能表现出强黏附功能的蛋白,也是目前开发新型生物黏附剂的主要候选分子。厚壳贻贝(Mytilus coruscus)广泛分布于我国东部沿海,是我国具有重要经济价值的贻贝,其足丝粗硬,黏附力强,关于厚壳贻贝的足丝蛋白的研究目前尚未见报道。通过醋酸抽提结合反相高效液相色谱分离,从厚壳贻贝足丝盘中分离纯化到数种低分子量足丝蛋白,经质谱鉴定和氨基酸序列测定,其中三种足丝蛋白(分子量6 kD左右)属于贻贝足丝蛋白-3(mytilus foot protein-3,mfp-3)家族,且序列中富含DOPA,另有三种足丝蛋白为未知新型足丝蛋白。石英晶体微天平分析表明,厚壳贻贝低分子量足丝蛋白在金表面有较强的吸附能力,这与其黏附功能是直接相关的。以上工作为深入了解厚壳贻贝低分子量足丝蛋白的分子多样性以及黏附机制奠定了基础。

利用质谱技术结合EST库搜索鉴定厚壳贻贝新型足丝蛋白(英文)

贻贝利用足丝粘附于水下各种基质表面.作为一种具有优异粘附性能的生物材料,贻贝足丝蛋白在新型水下粘附剂及表面保护涂层的研制与开发中具有重要的仿生学意义.目前,已报道的贻贝足丝蛋白分子达11种,但是仍然有更多的足丝蛋白分子不为人知.为进一步探讨贻贝足丝蛋白的分子多样性,并从中筛选具有特殊生物学功能的足丝蛋白分子,本文采用鸟枪法-液相色谱-质谱/质谱技术(shotgun-LC-MS/MS)对厚壳贻贝足丝蛋白进行了蛋白质组学分析.将厚壳贻贝足丝分为足丝纤维和足丝盘两部分,每一部分均采用醋酸-尿素溶液,以及醋酸-盐酸胍溶液进行蛋白质抽提;抽提后的足丝蛋白经胰蛋白酶酶解,利用线性离子阱四级杆质谱(LTQ)进行鸟枪法质谱分析.二级质谱图(MS/MS)用以搜索公共数据库中的贻贝表达序列标签(expressed sequence tag,EST)数据库.采用上述方法,获得14种贻贝新型足丝蛋白的高可信度结果及其所匹配的部分或全长cDNA序列;经结构域分析,发现上述新型贻贝足丝蛋白分子的序列中多数包含各种类型的结构域,包括胶原蛋白结构域、C1Q结构域、C1Q结合结构域、微管蛋白辅助折叠结构域、蛋白酶拮抗结构域、VWA结构域、几丁质酶结构域等.在此基础上,对上述新型足丝蛋白在贻贝足丝形成以及粘附方面的功能进行了推测.上述结果对进一步了解贻贝足丝的分子组成以及粘附机理奠定了基础.

紫贻贝足丝蛋白与活性肽的开发应用研究进展

我国是世界上最大的贻贝生产国,养殖面积高达3.5万公顷,年产量超过90万t。紫贻贝味道鲜美,营养丰富,干基中蛋白含量高达60%,是一种优质的海洋蛋白质资源,可作为生物功能蛋白和活性肽等生物活性物质资源的重要来源。国内紫贻贝主要以鲜销为主,腐蚀性高、销量少、效益低,提高紫贻贝的高值化利用是目前亟需解决的主要问题。研发紫贻贝蛋白资源利用的新途径,既可以开发紫贻贝的潜在市场,扩大紫贻贝的应用领域,又能带来显著的经济效益。紫贻贝蛋白的研究主要集中在贻贝足丝蛋白和活性肽2个方面,本文系统收集国内外相关研究报道,对其研究与应用现状进行综述,旨在为紫贻贝足丝蛋白及其活性肽相关生物制品、功能性食品等产品的进一步研发提供参考。

贻贝足丝蛋白的汞、镉抗性及富集机制

为探究贻贝足丝蛋白黏附重金属的机理及分子机制,对翡翠贻贝足丝蛋白进行转录组测序分析,使用Trinity软件从头组装,获得73 571个UniGenes.翡翠贻贝足部的UniGenes注释到基因本体(gene ontology,GO)数据库,共获得9 466个注释结果,通过基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)数据库注释后,发现有955个UniGenes被注释到关于黏着斑蛋白的通路中,推测足丝蛋白吸附重金属的功能与其密切相关.由于Pvfp6半胱氨酸、组氨酸和酪氨酸含量高,该蛋白可能对重金属有结合作用。将 pvfp6 基因克隆到pET-30a表达载体,转到大肠杆菌BL21 (DE3)表达。结果表明,含有pET-30a-pvfp6 质粒的宿主具有一定的抗汞和抗镉能力,能分别在含Hg^2+质量浓度为5mg/L,或者含Cd^2+质量浓度为160 mg/L的培养基中生长;重组菌对Hg^2+和Cd^2+的平衡富集量均高于对照组pET-30a,分别为109.89 mg/g和19.27mg/g.研究表明,足丝蛋白Pvfp6赋予了重组菌具有一定的抗汞和抗镉的能力,且富集能力增强.该研究可为海洋环境中重金属污染的生物治理奠定实验基础。

厚壳贻贝足丝盘黏附蛋白mcofp-3的重组真核表达

厚壳贻贝(Mytilus coruscus)黏附蛋白分子mcofp-3(M.coruscusfoot protein-3)主要分布于贻贝足丝盘,贻贝在水环境下的黏附过程中起到关键作用,但因其难溶于水且在贻贝足丝盘中含量极低,故妨碍了对其进行深入研究。为建立厚壳贻贝足丝蛋白mcofp-3的真核表达体系,并获得足够的mcofp-3黏附蛋白进行后续研究,采用酵母表达体系对mcofp-3进行了重组表达。通过PCR方法克隆厚壳贻贝的mcofp-3基因,构建mcofp-3的酵母真核表达载体pVT102U/α/mcofp-3,鉴定结果表明,重组表达质粒pVT102U/α/mcofp-3由真核载体pVT102U/α和mcofp-3的成熟肽DNA片段组成,插入的mcofp-3成熟肽DNA片段与预期序列完全一致;采用LiAC转化法将重组表达质粒转化到S78酿酒酵母中,经过RT-PCR分析以及1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测,结果表明,重组的mcofp-3得到了成功的转录;发酵菌液经阳离子交换柱及高效液相色谱分离,以及Tris-Tricine-SDS-PAGE检测,结果表明,重组的厚壳贻贝黏附蛋白分子mcofp-3得到了成功表达,表达产物分子量约为6kD,与预期分子量一致。

厚壳贻贝足丝黏附蛋白mfp-3重组表达及黏附功能分析

厚壳贻贝(Mytilus coruscus)中富含各种黏附蛋白分子,其中贻贝足丝蛋白3(mussel footprotein-3,mfp-3)是贻贝用以与外界基质进行黏附的主要蛋白分子.贻贝足丝中天然的mfp-3的含量低,水溶性差,因此纯化困难.本文以厚壳贻贝足丝蛋白mfp-3的cDNA序列为目的基因,用PCR法扩增Mfp-3基因,并成功构建含有多聚组氨酸标签的重组mfp-3原核表达载体pET-21a/Mfp-3.经IPTG(isopropylthio-β-D-galactoside)诱导表达出重组蛋白,利用亲和层析和反相高效液相色谱分离纯化,获得分子量为9.18 kD的重组蛋白.经酪氨酸酶催化、玻璃包被和石英晶体微天平(quartzcrystal microbalance,QCM)分析.结果表明,重组厚壳贻贝mfp-3蛋白经酪氨酸酶催化后,L-3,4-二羟基苯丙氨酸(即多巴,L-3,4-dihydroxyphenylalanine,DOPA)含量较高并且具有较好的黏附性能.上述研究为开发以mfp-3黏附蛋白为来源的生物粘合剂奠定了良好的基础.

厚壳贻贝足腺cDNA文库的构建及部分EST序列分析

为获得厚壳贻贝足腺组织的EST序列标签以及可能的功能基因序列,以pCMVsport6质粒为载体构建了高质量的厚壳贻贝足腺组织cDNA文库,文库滴度为1.31×107pfu/mL,重组率为98%,平均插入片段为1.3kb.通过对文库部分克隆的序列测定,获得了11个新基因和17个功能基因,其中包括部分与厚壳贻贝足丝相关的基因.厚壳贻足腺组织cD-NA文库的成功构建为将来筛选与厚壳贻贝足丝蛋白相关的新基因,系统研究其黏附机制奠定了基础.

海洋生物黏附蛋白研究进展

海洋附着生物粘合蛋白的研究对于生物粘合剂的开发及海洋防污行业均具有重要的意义。综述了对贻贝足丝蛋白,藤壶胶蛋白以及管栖毛虫管胶蛋白的研究进展。3种不同生物的黏附蛋白具有某些相似性,同时又各有其结构特点,对其蛋白质结构,功能及粘合机制的研究既具有重要的学术意义也具有广阔的应用前景。

钛表面贻贝蛋白包被对人真皮成纤维细胞粘附和增殖的影响

目的:观察人真皮成纤维细胞在两种贻贝足丝蛋白提取物Usun-afix和BD CELL-TAKTM试剂包被钛表面的粘附和增殖状况,研究贻贝蛋白包被法是否能够用于经皮种植体表面处理。方法:分别制备光滑钛片和两种贻贝蛋白包被的钛片样本,选取P3代人真皮成纤维细胞接种到3种培养基底上:①不做处理的光滑钛表面(对照组);②Usun-afix包被的钛表面;③BD CELL-TAKTM包被的钛表面。MTT法检测1、3、5 d细胞在3种钛表面的增殖数量;利用DiI-AcLDL荧光染色结合MTT法检测15、30 min和1、2、4 h时间点细胞的粘附状况。结果:培养1、3、5 d,成纤维细胞在3种表面活性均较好,3组之间无明显统计学差异(P>0.05);DiI-AcLDL荧光染色显示,在培养15、30 min和1 h各时间点,Usun-afix和BD CELL-TAKTM包被钛表面粘附细胞数目明显多于光滑钛表面,在1、2、4 h各时间点,两包被组与对照组相比有更好的细胞伸展形态;不同时间点MTT检测显示,两包被组在接种15、30 min和1、2 h各时间点的吸光度值均明显高于对照组(P<0.05),在4 h时,虽两包被组OD值比对照组略高,但无统计学差异(P>0.05);两包被组在各个时间点的促粘附效果相似,差异均无统计学意义(P>0.05)。结论:成纤维细胞接种早期(<4 h),可更容易粘附到两种贻贝足丝蛋白提取物Usun-afix和BD CELL-TAKTM试剂包被的钛表面,而贻贝蛋白对成纤维细胞的增殖能力没有明显的促进效果。

基于Illumina测序的厚壳贻贝足组织转录组研究

贻贝足丝是贻贝足组织分泌的足丝蛋白形成的非细胞组织,具有在水环境下的极强粘附性能,是当前生物粘附剂及抗腐蚀材料的研发热点.为进一步了解贻贝足丝蛋白的分子多样性特征,采用新一代Illumina高通量测序平台对厚壳贻贝(Mytilus coruscus)足组织进行转录组测序,首次构建了厚壳贻贝足组织的转录组数据库.共计获得7 199 799 840 nt的碱基数据.经过序列拼接和组装,获得88 825条unigene.对上述unigene开展了序列注释,共计37 007条unigene获得注释.在此基础上,经序列检索和比对,从中筛选出与目前已知的11种足丝蛋白同源的56条unigene序列并进行分析.结果表明,厚壳贻贝足丝蛋白具有明显的氨基酸偏好性,部分足丝蛋白具有重复序列,且厚壳贻贝足丝蛋白与其他种类的贻贝足丝蛋白具有较高的序列相似性.上述结果为后续贻贝足丝蛋白的批量鉴定以及在此基础上的贻贝足丝形成、固化以及粘附机制相关研究奠定了基础.

含儿茶酚基团的湿态组织粘附水凝胶

湿态粘附作用对于生命的孕育和发展具有重要意义。水凝胶是一类兼具固液特性的智能材料,组织粘附水凝胶因多功能性和生物相容性而被广泛应用于伤口闭合和修复、细胞工程、组织工程等领域。然而,湿态组织表面的水合层阻碍了组织粘附水凝胶与组织表面形成界面粘附键。面对这一挑战,受海洋贻贝足丝蛋白中DOPA的儿茶酚基团是水下粘附的关键结构的启发,含儿茶酚基团的湿态组织粘附水凝胶的研究引起了广泛关注。本综述介绍了贻贝足丝蛋白(Mfps)的结构及湿态粘附机理,并将儿茶酚衍生物分为天然Mfps或利用基因工程合成的Mfps、含儿茶酚基团的小分子化合物、儿茶酚基团改性的天然高分子以及含儿茶酚基团的合成功能高分子;随后,概述近十年含儿茶酚基团的湿态组织粘附水凝胶在组织创口修复材料、生物涂层材料、靶向型药物输送材料、生物电子设备材料的研究进展;文末,展望了此类水凝胶材料未来发展面临的机遇和挑战。

双组分快速固化生物软组织黏合剂的研制

贻贝足丝蛋白(MFp)是一类能够在水下迅速固化,并能黏附在不同基材表面的特殊蛋白质,作为蛋白类生物黏合剂具有广泛的应用前景。本文在大肠杆菌中高效可溶性地表达了贻贝足丝融合蛋白Sumo-Fp3(SFp3),并通过蘑菇酪氨酸酶在柱催化,将其中约5%的酪氨酸残基转化为DOPA。在含DOPA的SFp3(DSFp3)中加入分子量为1 500 kD的透明质酸后,形成的双组分生物胶水在牛皮表面的黏附力超过氰基丙烯酸盐组织粘合剂Dermabond?的两倍,并在5 min内达到最大黏附强度的52%。通过生物膜层干涉技术和扫描电子显微镜,观测到透明质酸与DSFp3存在静电层层组装行为,并形成紧密片层结构。本研究为蛋白质类生物胶水黏附强度低、固化慢提供了一种解决方法和理论基础。