嘌呤霉素损伤小鼠肾小球足细胞系中足细胞α-辅肌动蛋白4的表达与分布

目的观察嘌呤霉素（PAN）对足细胞α-辅肌动蛋白4（α-actin-4）mRNA表达和分布的影响，探讨α-actin-4与足细胞损伤的关系。方法将体外培养肾小球足细胞系（MPC5）随机分为实验组与对照组。实验组采用PAN刺激（剂量为50mg／L），分别于8h、24h和48h观察细胞形态，提取总RNA和细胞免疫组织化学观察α-actin-4的分布。对照组用100mL／LFBS的RPMI1640培养液培养。应用Image J图像软件处理细胞图像，计算2组随机选择的30个细胞在上述3个时间点200倍镜下的细胞相对面积，实时定量荧光聚合酶链反应（RT—PCR）和间接免疫荧光法检测α-actin-4mRNA表达和分布变化。结果对照组足细胞生长情况良好，胞体呈不规则星形，与增殖状态足细胞比较，细胞体和细胞核均显著增大，自胞体伸出树枝样突起，相邻细胞问足突相互连接。实验组细胞胞体缩小，足突回缩、消失，细胞间失去相互连接。2组间α-ctin-4mRNA各时间点表达比较，8h差异无统计学意义（P＞0．05），24h、48h差异有统计学意义（P均＜0．01），实验组在24h、48h后α-actin-4mRNA表达升高。对照组α-actin-4在胞质内呈细丝状均匀分布，在足突中呈放射状分布；8h后在实验组α-actin-4压力丝纤维变短，排列紊乱，PAN刺激24h后细胞质中α-actin-4分布明显减少，刺激48h后出现细胞质分布缺失。结论α-actin-4表达分布的异常与PAN损伤足细胞的时间呈正相关，α-actin-4是足细胞损伤机制中的一个重要分子。

六味地黄汤对阿霉素肾病小鼠尿蛋白及肾小球p-p38 MAPK、α-actinin-4、synaptopodin的影响

目的探讨六味地黄汤对阿霉素肾病(adriamycin nephropaghy,ADRN)小鼠尿蛋白的干预作用及可能机制。方法30只SPF级雄性C57BL/6小鼠随机选取5只为空白组,余下小鼠以单次尾静脉注射阿霉素(0.01 g·kg^(-1))复制ADRN模型,2周后将造模成功的小鼠随机分为模型组、贝那普利组及低、中、高剂量六味地黄汤组,每组5只。空白组、模型组予等体积注射用水灌胃,贝那普利组予0.0013 g·kg^(-1)贝那普利灌胃,低、中、高剂量六味地黄汤组分别予9.75、19.5、39 g·kg^(-1)六味地黄汤灌胃,每日1次,连续8周。自动生化仪检测小鼠24 h尿蛋白定量、血清白蛋白、血清肌酐、血清钾;HE染色法、电镜观察小鼠肾脏病理改变及足突形态;免疫组织化学法、Western bolt检测小鼠肾脏磷酸化p38 MAPK(phosphorylated p38 MAPK,p-p38 MAPK)、α-辅肌动蛋白-4(α-actinin-4)、突触孔蛋白(synaptopodin)的表达;RT-PCR检测小鼠肾脏α-actinin-4、synaptopodin mRNA表达。结果与空白组比较,模型组小鼠体质量、24 h尿量、血清白蛋白降低,24 h尿蛋白定量升高(P<0.05);肾小球系膜细胞增生,部分系膜区扩大、肾小管蛋白管型,间质可见炎性细胞浸润,足突广泛融合;α-actinin-4蛋白及mRNA、p-p38 MAPK蛋白表达升高(P<0.05),synaptopodin蛋白及mRNA表达降低(P<0.05)。与模型组比较,各干预组病理改变及足突融合均得到不同程度改善,贝那普利组及中、高剂量六味地黄汤组24 h尿蛋白定量减少,高剂量六味地黄汤组p-p38 MAPK蛋白表达降低(P<0.05),低、中、高剂量六味地黄汤组synaptopodin蛋白及mRNA表达均升高(P<0.05)。贝那普利组及低、中、高剂量六味地黄汤组组间比较,各指标差异无统计学意义(P>0.05)。结论六味地黄汤可能通过抑制p38 MAPK通路活化和上调α-actinin-4、synaptopodin蛋白及mRNA表达,改善肾脏病理及足突融合,减轻足细胞损伤,减少ADRN小鼠尿蛋白。

α-辅肌动蛋白4对卵巢癌细胞增殖、凋亡及化疗敏感性的影响及其机制

目的:探讨体外沉默α-辅肌动蛋白4(alpha-actinin-4,ACTN4)基因的表达对卵巢癌细胞增殖、凋亡及化疗敏感性的影响及其可能的机制。方法:化学合成靶向ACTN4基因的ACTN4-siRNA,体外转染至人卵巢癌细胞株SKOV3和OVCA429中,采用real-time PCR检测ACTN4 mRNA的表达,采用MTT法检测卵巢癌细胞的增殖能力及存活率,采用流式细胞术检测卵巢癌细胞的凋亡情况,采用Western blotting检测凋亡相关蛋白的表达。结果:ACTN4-siRNA转染SKOV3/OVCA429细胞后,ACTN4的mRNA及蛋白的表达均明显下降;细胞增殖能力明显受到抑制。在不同浓度紫杉醇作用下,与转染CtrlsiRNA的对照组相比,ACTN4-siRNA转染组SKOV3/OVCA429的细胞存活率均显著降低,即转染ACTN4-siRNA后的SKOV3/OVCA429细胞对紫杉醇的敏感性明显增加(P<0.01)。SKOV3细胞瞬时转染ACTN4-siRNA48 h后,细胞凋亡率[(7.22±0.31)%]明显高于转染Ctrl-siRNA的对照组[(2.07±0.08)%];OVCA429细胞的情况与之一致,转染ACTN4-siRNA后细胞凋亡率为[(23.37±0.18)%],对照组为[(19.49±0.19)%],差异均有统计学意义(P<0.05)。转染ACTN4-siRNA后,SKOV3/OVCA429中p-Akt和p-FAK蛋白表达明显减少,抗凋亡蛋白Bcl-2表达明显减少,而促凋亡蛋白Bid和Bim表达则明显增加。结论:ACTN4可以降低卵巢癌细胞的化疗敏感性,这种作用可能通过抑制细胞凋亡实现。

血清KLF5和actinin-4水平与肝细胞肝癌肝动脉化疗栓塞术治疗预后的关系

目的探讨血清Krüpple样因子5(KLF5)、辅肌动蛋白4(actinin-4)对肝细胞肝癌(HCC)肝动脉化疗栓塞术(TACE)治疗预后的关系。方法选取西安交通大学第二附属医院2015年3月至2020年3月期间收治的130例HCC患者作为HCC组,同期收治的86例肝硬化患者作为对照。术后随访3年,根据生存结局分为生存组(n=38)和死亡组(n=92)。采用ELISA检测各组血清KLF5和actinin-4水平,并分析血清KLF5与actinin-4水平之间的相关性;Cox回归分析HCC患者预后死亡的影响因素;受试者工作特征曲线(ROC)评估血清KLF5和actinin-4水平对HCC患者预后死亡的预测价值。结果死亡组患者血清KLF5和actinin-4水平明显高于生存组(P<0.05),且血清KLF5与actinin-4水平呈正相关(P<0.001);低分化、中国肝癌分期方案(CNLC)分期为Ⅲa期、血管侵犯、KLF5和actinin-4水平升高是HCC患者预后死亡的危险因素(P<0.05);血清KLF5和actinin-4单独及联合预测HCC患者预后死亡的曲线下面积(AUC)分别为0.835、0.866、0.936,联合预测效果较高(Z二者联合-KLF5=2.792,P=0.005,Z二者联合-actinin-4=2.014,P=0.044)。结论HCC患者血清KLF5和actinin-4水平升高,二者血清水平对预后具有较高预测价值。

糖尿病大鼠肾脏α-辅肌动蛋白-4表达变化及作用机制

目的:动态观察肾小球足细胞骨架蛋白α-辅肌动蛋白-4(α-actinin-4)在糖尿病大鼠模型肾组织中表达的变化,探讨α-actinin-4与蛋白尿发生的关系及导致其出现变化的可能机制。方法:将SD大鼠随机分为两组:对照组及糖尿病组,腹腔注射链脲佐菌素(STZ)制作糖尿病大鼠模型,分别于2、4、6、8周末检测每组大鼠24h尿蛋白定量并处死大鼠留取肾标本。电镜观察足细胞超微结构的变化;应用酶免法检测肾组织糖基化终产物(AGEs)的含量;应用免疫组化及Western-blot检测α-actinin-4蛋白的表达;RT-PCR检测α-actinin-4mRNA表达量的变化。结果:6周糖尿病组大鼠24h尿蛋白明显高于对照组(P<0.01),增高持续到8周(P<0.01);透射电镜显示8周糖尿病组大鼠足突出现节段性融合;从4周时糖尿病组大鼠肾组织AGEs含量明显升高(P<0.05),并持续到8周(P<0.01);与对照组相比,从4周时糖尿病组大鼠肾组织α-actinin-4蛋白表达明显降低(P<0.05),并持续到8周(P<0.05);与对照组相比,从2周时糖尿病组大鼠肾组织α-actinin-4mRNA表达明显降低(P<0.05),并持续到8周(P<0.01)。结论:α-actinin-4表达降低参与了糖尿病大鼠蛋白尿的发生,而AGEs可能是导致α-actinin-4表达下调的原因之一。

儿童原发性肾病综合征α-辅肌动蛋白4mRNA表达的临床意义

目的探讨在儿童原发性肾病综合征中α-辅肌动蛋白4(α-actinin-4)mRNA表达及其意义。方法经肾活检获取34例原发性肾病综合征患儿(病例组)的肾组织,其中局灶节段硬化性肾小球肾炎(FSGS)21例、微小病变(MCNS)6例、系膜增生性肾小球肾炎(MsPGN)7例;另外,12例对照组标本取自肾肿瘤切除术后肿瘤周边的正常组织。通过实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR)的方法检测每份肾组织中α-actinin-4 mRNA表达,同时分析FSGS患儿中mRNA表达与24 h尿蛋白、内生肌酐清除率(Ccr)的相关性。结果 FSGS组α-actinin-4 mRNA表达明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05),而MCNS组和MsPGN组α-actinin-4 mRNA表达与正常对照组的差异均无统计学意义(P>0.05)。在FSGS组中,表现为肾炎型肾病(伴发镜下血尿)患儿的α-actinin-4 mRNA表达明显高于表现为单纯性肾病的患儿,差异有统计学意义(P<0.05);FSGS患儿α-actinin-4mRNA表达量与24 h尿蛋白及Ccr无相关性(P>0.05)。结论在儿童原发性肾病综合征中,α-actinin-4 mRNA表达量增高可能是促进肾小球足细胞骨架修复的因素之一;该骨架分子的mRNA表达变化与病程及病理类型相关。

α-辅肌动蛋白4及其与肾脏疾病关系的研究进展

α-辅肌动蛋白4是由ACTN4基因编码的辅肌动蛋白家族成员之一,广泛表达于各种组织或器官,在肾脏中其主要表达于肾小球足细胞。α-辅肌动蛋白4与去氧肾上腺素、足突蛋白和CD2相关蛋白等的相互作用共同维系肾小球足细胞正常结构及功能。多种肾脏疾病存在ACTN4基因突变及α-辅肌动蛋白4表达、分布异常。本文主要就α-辅肌动蛋白4对肾脏疾病的影响以及在治疗中的应用研究进展做一综述。

双氢青蒿素抑制TLR4/NF-κB信号通路对高糖刺激的足细胞功能障碍的改善作用

目的探究双氢青蒿素通过调控Toll样受体4(TLR4)/核因子-κB(NF-κB)信号通路对D-葡萄糖诱导的人肾小球足细胞(HGPC)炎症、增殖、迁移和侵袭的影响。方法体外培养HGPC细胞,将HGPC细胞分为对照组(5 mmol·L^(-1)D-葡萄糖)、高糖组(30 mmol·L^(-1)D-葡萄糖)和不同浓度双氢青蒿素组(30 mmol·L^(-1)D-葡萄糖+5、10、20、40μmol·L^(-1)双氢青蒿素),筛选出合适的双氢青蒿素作用浓度;随后将细胞分为对照组、高糖组、双氢青蒿素组(30 mmol·L^(-1)D-葡萄糖+20μmol·L^(-1)双氢青蒿素)、抑制剂组(30 mmol·L^(-1)D-葡萄糖+5μmol·L^(-1)NF-κB通路抑制剂BAY 11-7082)、双氢青蒿素+抑制剂组(30 mmol·L^(-1)D-葡萄糖+20μmol·L^(-1)双氢青蒿素+5μmol·L^(-1)BAY 11-7082)和双氢青蒿素+激活剂组(30 mmol·L^(-1)D-葡萄糖+20μmol·L^(-1)双氢青蒿素+1μmol·L^(-1)NF-κB通路激活剂Prostratin),干预24 h。细胞计数试剂盒细胞8(CCK-8)法检测细胞活力;酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测炎症因子白细胞介素(IL)-1β和IL-8的表达水平;5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷(EdU)法检测细胞的增殖能力;Transwell小室法检测细胞迁移和侵袭能力;蛋白免疫印迹(Western Blot)法检测细胞周期蛋白D1(CyclinD1)、基质金属蛋白酶9(MMP-9)和TLR4/NF-κB通路相关蛋白表达水平。结果CCK-8法检测结果显示20μmol·L^(-1)双氢青蒿素对D-葡萄糖HGPC细胞活力恢复效果最好,因此选择20μmol·L^(-1)双氢青蒿素用于后续实验。与对照组比较,高糖组细胞增殖率和CyclinD1蛋白相对表达量明显降低(P<0.05),炎症因子(IL-1β和IL-8)、迁移数、侵袭数、MMP-9、TLR4和磷酸化(p)-NF-κB p65蛋白相对表达量明显升高(P<0.05);双氢青蒿素组、抑制剂组、双氢青蒿素+抑制剂组及双氢青蒿素+激活剂组中双氢青蒿素和BAY11-7082明显抑制了D-葡萄糖对HGPC细胞的上述作用(P<0.05);与双氢青蒿素组比较,双氢青蒿素+抑制剂组中BAY11-7082增强了双氢青蒿素对D-葡萄糖诱导的HGPC细胞的作用(P<0.05),双氢青蒿素+激活剂组中Prostratin则削弱了双氢青蒿素对D-葡萄糖诱导的HGPC细胞的作用(P<0.05)。结论双氢青蒿素能抑制D-葡萄糖诱导的HGPC细胞迁移和侵袭,并促进其增殖,能有效改善D-葡萄糖刺激对HGPC细胞的炎症损伤,其作用机制可能与阻滞TLR4/NF-κB信号通路信号转导有关。

肾病患者血管生成素样蛋白-4与人足细胞损伤的相关性研究

目的观察不同病理类型肾病患者血清及尿液血管生成素样蛋白-4(Angptl4)的表达与促细胞损伤的相关性,探讨其临床意义。方法选取肾穿刺活检患者193例,根据病理类型分为微小病变肾病组(MCD组,n=59)、膜性肾病组(MN组,n=46)、IgA肾病组(IgA-N,n=46),选取微小病变肾病完全缓解(MCD-CR组,n=42)作为对照组,检测各组血清及尿液Angptl4水平,并与24小时尿蛋白定量(24U-TP)、血清清蛋白(ALB)、三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC)、血肌酐(Scr)进行相关性分析;镜下观察肾组织病理改变。结果 MCD组、MCD-CR组血清Angptl4水平高于MN组、IgA-N组(P<0.05);MCD组、MN组尿液Angptl4水平高于MCD-CR组及IgA-N组(P<0.05)。血清Angptl4水平在MCD组中与24U-TP、TG呈正相关(P<0.05),与ALB呈负相关(P<0.05);尿液Angptl4水平在MCD组、MN组中与24U-TP、TG呈正相关(P<0.05),与ALB呈负相关(P<0.05),在IgA-N组中与24U-TP呈正相关(P<0.05)。IgA-N组肾小球基底膜空泡变性,系膜细胞和基质轻度增生,足细胞未见明显异常。与IgA-N相比,MN组、MCD组肾小球存在显著的足细胞增生、肿胀伴空泡变性。结论尿液Angptl4水平的高低反映了蛋白尿的严重程度,可能有助于评估早期的足细胞损伤。

1,25-二羟维生素D_3对糖尿病肾病大鼠足细胞Angptl4、Desmin表达的影响

目的探讨1,25-二羟维维生素D3[1,25-(OH)_2D_3]对糖尿病肾病(DN)大鼠足细胞损伤的影响及其可能的机制。方法选择雄性SD大鼠30只,取其中22只采用一次性腹腔注射STZ的方法制备糖尿病模型,将造模成功的18只大鼠随机分为DN模型组(M组)、1,25-(OH)_2D_3干预组(D组)各9只,另将未造模的8只大鼠作为正常对照组(N组)。D组在DN模型建立后予1,25-(OH)_2D_30.1μg/(kg·d)灌胃,M组给予等量橄榄油灌胃,N组给予等量蒸馏水灌胃。均干预12周后,收集各组大鼠24 h尿液,采用双缩尿法测定24 h尿蛋白(24 h Upro),采用ELISA法测定尿血管生成素样蛋白4(Angptl4)水平。眼球取血,分离血清,采用全自动生化分析仪测定血BUN、SCr水平,采用ELISA法测定血Angptl4水平。取各组大鼠右肾组织,采用HE染色观察肾组织病理变化。取各组大鼠肾组织,分别采用免疫组化SP法、Western blotting法检测肾组织Angptl4、结蛋白(Desmin)蛋白表达。结果与N组相比,M组、D组24 h Upro、尿Angptl4、血BUN、Scr均升高,血Angptl4水平均降低(P均<0.05);与M组相比,D组24 h Upr、尿Angptl4、血BUN、Scr均降低,血Angptl4水平升高(P均<0.05)。病理检查示,M组可见毛细血管球肥大,肾小球基底膜部分增厚,系膜增生。电镜结果示,M组肾小球基底膜增厚、足突融合,D组肾脏病理改变较M组减轻。与N组相比,M组肾组织Angptl4、Desmin蛋白表达均上调(P均<0.05);与M组相比,D组肾组织Angptl4、Desmin蛋白表达均下调(P均<0.05)。结论 1,25-(OH)_2D_3可减轻DN大鼠的肾损伤,其机制可能与抑制足细胞分泌Angptl4、Desmin蛋白,从而发挥对肾小球足细胞的保护作用有关。

mitoTEMPO通过调控线粒体自噬对慢性肾脏病模型大鼠足细胞损伤的保护作用研究

目的 探讨线粒体靶向的2, 2, 6, 6-四甲基哌啶-1-氧基-4-氨基-2-氧基乙基(mitochondria-targeted 2, 2, 6, 6-tetramethylpiperidin-1-oxyl-4-amino-2-oxyethl,mitoTEMPO)对慢性肾脏病(chronic kidney disease,CKD)模型大鼠足细胞损伤的影响及其相关分子机制。方法 18只健康SD大鼠随机分为对照(Control)组、模型组(CKD组)和mitoTEMPO组,每组6只。采用全自动生化分析仪测定肾功能;苏木素-伊红染色检测肾病理结构;免疫组织化学法检测肾脏肌间质蛋白(desmin)和足突蛋白(podocin)表达;透射电镜检测足细胞超微结构;免疫荧光共染检测足细胞线粒体自噬;实时荧光定量PCR检测肾脏炎性因子表达;蛋白免疫印迹法检测Nod样受体家族成员蛋白3(nod-like receptor protein 3,NLRP3)炎症小体,自噬和帕金蛋白(Parkin)/PTEN诱导假定激酶1(PTEN induced putative kinase1,PINK1)通路相关蛋白表达。结果 与Control组比较,CKD组大鼠24h尿蛋白(84.89±8.98 mg/24h vs 5.79±1.39mg/24h),血清肌酐(serum creatinine,Scr)(75.10±10.46μmol/L vs 38.57±4.89μmol/L),尿素氮(urea nitrogen,BUN)(8.96±1.07 mmol/L vs 2.73±0.43mmol/L)水平升高,差异具有统计学意义(t=21.322,7.749,13.233,均P<0.001);肾小球体积增大、系膜增生、大量炎性细胞浸润;足细胞足突融合,基底膜增厚,线粒体嵴断裂和空泡化;desmin阳性区增多,podocin阳性区减少,差异具有统计学意义(t=9.903,7.651,均P<0.001);p62和desmin可见共定位;LC3 II/I,PINK1和Parkin蛋白表达降低(t=16.984,15.105,11.390),IL-1β,TNF-α,NLRP3,cleaved caspase-1和p62蛋白表达升高(t=5.700~21.571),差异具有统计学意义(均P<0.001)。与CKD组比较,mitoTEMPO组24h尿蛋白、Scr和BUN水平降低,差异具有统计学意义(t=12.508,4.712,7.338,均P<0.001);肾脏病理损伤和足细胞情况显著改善;desmin阳性区减少,podocin阳性区增多(t=6.649,7.686,均P<0.001);LC3和COX IV可见共定位;LC3 II/I,PINK1和Parkin蛋白表达升高(t=15.481,20.469,5.801),IL-1β,TNF-α,NLRP3,cleaved caspase-1和p62蛋白表达降低(t=3.477~9.681),差异具有统计学意义(均P<0.001)。结论mitoTEMPO对CKD足细胞损伤可产生保护作用,其机制可能与激活PINK1/parkin通路介导的线粒体自噬来抑制NLRP3炎症小体有关。

血清SDF-1α、CXCR4与糖尿病足溃疡感染、病情程度及预后的相关性

目的探讨血清基质细胞衍生因子-1α(SDF-1α)、趋化因子受体4(CXCR4)与糖尿病足溃疡(DFU)患者感染、病情程度及预后的相关性。方法回顾性选取2020年9月至2022年5月在北京市大兴区人民医院进行治疗的150例DFU患者作为观察对象。根据DFU严重程度进行分级:Wagner分级1级32例,2级39例,3级45例,4级34例。按照DFU感染严重程度分级,无感染23例,轻度感染42例,中度感染48例,重度感染37例。根据患者6个月内预后情况将患者分为预后良好组103例与预后不良组47例。收集患者临床资料[年龄、性别、合并疾病(高血压、糖尿病肾病、周围神经病变、糖尿病视网膜病变)感染程度、Wagner分级、白细胞计数、空腹血糖、糖化血红蛋白(HbA1c)、超敏C-反应蛋白(hs-CRP)、降钙素原及血脂水平],采用酶联免疫吸附试验检测血清SDF-1α、CXCR4水平,受试者工作特征(ROC)曲线分析血清SDF-1α、CXCR4对DFU患者预后不良的诊断价值,Logistics回归分析影响DFU患者预后不良的危险因素。结果DFU患者血清SDF-1α、CXCR4水平随着感染严重程度及Wagner分级升高而逐渐降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。预后不良组与预后良好组年龄、性别、合并疾病患者比例及白细胞计数、空腹血糖、HbA1c、血脂水平之间比较,差异均无统计学意义(P>0.05);与预后良好组比较,预后不良组糖尿病病程,中、重度感染,Wagner分级3~4级患者比例及血清hs-CRP、降钙素原水平显著升高,SDF-1α、CXCR4水平显著降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。糖尿病病程、Wagner分级、hs-CRP是影响DFU患者预后不良的独立危险因素(P<0.05),SDF-1α、CXCR4是影响DFU患者预后不良的保护因素(P<0.05)。血清SDF-1α、CXCR4联合诊断DFU患者预后不良的AUC为0.914(95%CI:0.858~0.954),敏感度为87.23%,特异度为84.47%,血清SDF-1α、CXCR4联合诊断DFU预后不良的AUC显著高于血清SDF-1α、CXCR4单独诊断(Z=2.081,P=0.037;Z=2.146,P=0.031)。结论DFU患者血清SDF-1α、CXCR4水平随感染及病情严重程度升高而降低,与患者预后有关,二者联合对DFU患者预后不良有一定诊断价值。

STAT3通过血小板反应蛋白4诱导足细胞凋亡及炎症反应

目的:探讨血小板反应蛋白4(thrombospondin-4,TSP-4)对高糖(high glucose,HG)刺激足细胞增殖、凋亡、氧化应激及炎症反应的潜在影响,揭示TSP-4在糖尿病肾脏病(diabetic kidney disease,DKD)发生发展中的作用。方法:(1)通过实时荧光定量聚合酶链反应和蛋白质印迹法检测HG诱导的足细胞中TSP-4和信号转导因子和转录激活因子3(signal transducer and activator of transcription3,STAT3)的表达水平;(2)在HG诱导的足细胞中干扰TSP-4后,通过细胞计数试剂盒(cell counting kit-8,CCK-8)和5-乙炔基-2′脱氧尿嘧啶核苷(5-ethynyl-2’-deoxyuridine,EdU)测定增殖能力;通过流式细胞术测定足细胞的凋亡和细胞周期分布;使用试剂盒检测活性氧(reactive oxygen species,ROS)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和过氧化氢酶(catalase,CAT)的相对含量。此外,通过酶联免疫吸附法检测炎症因子白细胞介素(interleukin,IL)-1β、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α和IL-6的表达水平;(3)应用染色质免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation,ChIP)验证转录因子STAT3与TSP-4的启动子区域的关系,并通过双荧光素酶报告基因检测进一步验证。结果:(1)TSP-4和p-STAT3在HG诱导的足细胞中呈时间依赖性上调(P<0.05);(2)干扰TSP-4可以逆转HG诱导的足细胞凋亡、氧化应激、炎症反应和受抑制的增殖(P<0.05);(3)STAT3可以结合TSP-4的启动子区域,从而诱导转录,对TSP-4启动子活性具有正向调控作用。结论:干扰TSP-4可减轻HG诱导的足细胞凋亡、氧化应激和炎症反应,对足细胞具有保护作用;转录因子STAT3对TSP-4基因启动子活性具有正向调控作用。

肾脏足细胞B7-1抗原呈递与CTLA4-Ig研究进展

作为肾小球滤过屏障主要组成部分的足细胞,在特定致炎因素诱导下,可具有抗原呈递的特性,扮演非专职抗原呈递细胞的角色,并启动自身免疫反应,从而导致足细胞损伤和蛋白尿,可能在糖尿病肾病、狼疮性肾炎、微小病变肾病、局灶节段性肾小球硬化及膜性肾病等肾小球足细胞疾病的发病中起作用。因此,阻断由足细胞启动的抗原呈递过程,有望为治疗此类疾病的新的途径。近年来,抗原呈递阻断剂CTLA4-Ig融合蛋白制剂在肾小球疾病的临床实践证实了这种可能,本文就肾脏足细胞B7-1抗原呈递与CTLA4-Ig的研究进展作一综述。

高糖环境对小鼠足细胞骨架结构及相关蛋白的影响

目的探讨高糖培养环境对小鼠足细胞骨架结构及相关蛋白表达及分布的影响。方法体外培养和分化小鼠足细胞,分为正常对照组、高渗对照组和高糖组。免疫荧光法观察足细胞内肌动蛋白纤维骨架(F-actin)、黏着斑蛋白(vinculin)及α-actinin-4的表达及分布。Western blotting半定量检测各组足细胞α-actinin-4和vinculin蛋白的表达。结果正常对照组和高渗对照组足细胞内F-actin以张力纤维丝的形式存在,α-actinin-4主要分布在细胞周边、肌动蛋白微丝以及细胞膜皱褶中;与正常对照组和高渗对照组比较,高糖组足细胞内F-actin形成的张力纤维显著减少,α-actinin-4分布向细胞内部集中;各组vinculin的分布无明显差异。Western blotting检测结果显示:高糖组α-actinin-4蛋白的表达显著低于正常对照组(P<0.001),各组vinculin蛋白的表达量比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论高糖可能刺激足细胞肌动蛋白细胞骨架结构重排,引起α-actinin-4的表达和分布改变。

白花丹醌对人肝星状细胞Nox4/ROS及α-SMA生成的影响

目的:研究白花丹醌(plumbagin)对转化生长因子β1(TGF-β1)刺激的体外培养人肝星状细胞(HSC-LX2)NADPH氧化酶4(Nox4)的mRNA和蛋白表达、活性氧簇(ROS)水平及α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)蛋白表达的影响。方法:体外培养HSC-LX2,随机设立空白组、TGF-β1刺激的模型组、TGF-β1+plumbagin(2μmol/L、1.5μmol/L及1μmol/L)组;细胞与各药物共同孵育72 h后,采用RT-PCR检测细胞Nox4 mRNA的表达;原位装载探针法测定细胞内ROS的水平;Western blot检测细胞内Nox4和α-SMA的蛋白含量。结果:与模型组比较,白花丹醌作用72 h后,2μmol/L和1.5μmol/L plumbagin能明显降低HSC-LX2细胞Nox4 mRNA和蛋白的表达(P<0.01),下调ROS水平,降低α-SMA的蛋白表达(P<0.01)。结论:Plumbagin可能是通过下调Nox4的表达进而降低ROS生成从而发挥其抑制HSC-LX2细胞活化的作用。

鳖甲煎丸含药血清通过调控TLR4-NF-κB通路抑制血小板衍生生长因子诱导的肝星状细胞激活

目的研究鳖甲煎丸(Biejiajian Pill,BJJ)含药血清对血小板衍生生长因子(platelet derived growth factor,PDGF)诱导肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSC)活化的抑制作用及其机制。方法通过PDGF诱导HSC激活并给予鳖甲煎丸含药血清处理,MTT实验检测PDGF处理后HSC细胞增殖活性,EdU染色检测HSC细胞增殖。ELISA实验检测HSC激活相关细胞因子,最后通过Western blotting实验研究Toll样受体-4(Toll-like receptor 4,TLR 4)/核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)信号通路相关蛋白表达情况。结果MTT和EdU实验结果显示鳖甲煎丸含药血清可显著抑制PDGF引起的HSC细胞增殖活性;ELISA实验结果显示鳖甲煎丸含药血清可显著降低PDGF处理后HSC中Ⅰ型胶原(collagen typeⅠ,Col-Ⅰ)、白介素-6(interleukin 6,IL-6)、PDGF-AA和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor alpha,TNF-α)含量;并可显著抑制PDGF处理后TGF-β1和α-SMA表达;免疫印迹实验显示鳖甲煎丸含药血清可抑制TLR4、p-IKK表达并升高p-IκBα表达。结论鳖甲煎丸含药血清可通过作用于TLR4-NF-κB信号通路抑制HSC细胞增殖和激活。

铁死亡诱导剂RAS合成致死分子3抑制病理性瘢痕成纤维细胞的纤维化

背景:病理性瘢痕主要表现为异常的细胞外基质积累和过度的成纤维细胞增殖,成纤维细胞过度增殖就会产生大量以胶原纤维为主的细胞外基质。因此深入探讨成纤维细胞纤维化在病理性瘢痕形成中的作用,将为揭示病理性瘢痕的机制和生物学治疗提供新思路。目的:探讨铁死亡诱导剂RAS合成致死分子3(RAS-selective lethal small molecule 3,RSL3)对人病理性瘢痕成纤维细胞纤维化的影响。方法:收集10例宁夏医科大学总医院烧伤整形美容科提供的病理性瘢痕组织和同一个体正常皮肤组织,提取人病理性瘢痕成纤维细胞和人正常皮肤成纤维细胞用于后续实验;苏木精-伊红染色观察病理性瘢痕组织和正常皮肤组织的形态;倒置显微镜观察病理性瘢痕成纤维细胞和正常皮肤成纤维细胞的外观形态;免疫荧光实验验证所提取的细胞是否为成纤维细胞;用不同浓度的RSL3(1,3,5,7,9,11,13μmol/L)干预细胞,CCK-8法检测RSL3作用于成纤维细胞的半数抑制浓度(IC_(50));设置对照组(不做处理)和RSL3干预组(用7μmol/L的RSL3干预细胞24 h),qRT-PCR和Western blot检测谷胱甘肽过氧化物酶4、Ⅰ型胶原蛋白、Ⅲ型胶原蛋白和α-平滑肌肌动蛋白的mRNA和蛋白的表达;检测细胞丙二醛浓度;划痕试验检测细胞划痕后24 h剩余划痕面积,并计算剩余划痕面积百分比。结果与结论:①与正常皮肤组相比,病理性瘢痕组的谷胱甘肽过氧化物酶4高表达(mRNA:t=3.252,P<0.01;蛋白:t=5.075,P<0.01);②与正常皮肤成纤维细胞组相比,病理性瘢痕成纤维细胞组的谷胱甘肽过氧化物酶4高表达(mRNA:t=10.32,P<0.01;蛋白:t=26.22,P<0.01);③与对照组相比,RSL3干预组谷胱甘肽过氧化物酶4表达减少(mRNA:t=2.798,P<0.05;蛋白:t=4.643,P<0.01),丙二醛浓度上升(t=2.917,P<0.05),Ⅰ型胶原蛋白(mRNA:t=15.84,P<0.01;蛋白:t=4.610,P<0.01)、Ⅲ型胶原蛋白(mRNA:t=28.86,P<0.01;蛋白:t=7.713,P<0.01)和α-平滑肌肌动蛋白(mRNA:t=2.671,P<0.05;蛋白:t=7.417,P<0.01)的表达减少,迁移能力减弱(t=14.06,P<0.01);④提示RSL3通过抑制谷胱甘肽过氧化物酶4的表达,进而抑制病理性瘢痕成纤维细胞的纤维化和迁移能力。

α-辅肌动蛋白-4与足细胞疾病

α-actini。（辅肌动蛋白）-4是新近发现的-种肌动蛋白交联蛋白，是血影蛋白超家族中的成员之-，在人体内广泛表达，在肾小球主要表达于足细胞，通过调节actinin的聚合和解聚而稳定足细胞细胞骨架结构和足突形态。Ot-辅肌动蛋白-4的编码基因ACTN4突变可导致常染色体显性遗传的家族性局灶节段性。肾小球硬化，还可在足细胞疾病中引起a-辅肌动蛋白-4表达和分布的异常。本文主要就其分子结构、组织学分布、生物学功能及其在足细胞疾病中的致病作用作-综述。

他克莫司对嘌呤霉素损伤的足细胞中α-辅肌动蛋白-4表达的影响

目的研究他克莫司( FK506)和嘌呤霉素( PAN)对肾小球足细胞凋亡和α-辅肌动蛋白-4(α-actinin-4)mRNA及蛋白表达的影响,探讨FK506对足细胞的保护作用.方法体外培养小鼠肾小球足细胞,设置对照组、PAN组和FK506组,处理8 h、24 h、48 h后观察细胞形态,检测细胞凋亡率,并收集细胞进行实时荧光定量-PCR、Western blot检测α-actinin-4的mRNA及蛋白表达情况.结果 PAN组各时间段胞体面积较对照组明显缩小,FK506组胞体面积较PAN组增大.8 h时各组间足细胞凋亡率无明显差异(均P>0. 05);24 h及48 h时PAN组足细胞凋亡率[(8. 21 ± 0. 41)%、(16. 32 ± 0. 17)%]较对照组[(4. 28 ± 0. 35)%、(6. 27 ± 0. 28)%]明显升高,差异均有统计学意义(均P<0. 05),FK506组足细胞凋亡率[(6. 26 ± 0. 24)%、(13. 32 ± 0. 24)%]均明显低于PAN组,差异均有统计学意义(均P<0. 05).8 h时各组α-actinin-4 mRNA和蛋白表达无明显差异(均P>0. 05),24 h、48 h 时PAN组mRNA(2. 42 ± 0. 21、3. 78 ± 0. 25)和蛋白(0. 77 ± 0. 04、1. 22 ± 0. 10)表达量较对照组mRNA(1. 50 ± 0. 22、2. 15 ± 0. 15)和蛋白(0. 44 ± 0. 03、0. 83 ± 0. 07)显著增高,差异均有统计学意义(均P<0. 01);FK506组mRNA(1. 65 ± 0. 24、1. 70 ± 0. 32)和蛋白(0. 52 ± 0. 05、0. 56 ± 0. 07)表达量均明显低于PAN组,差异均有统计学意义(均P<0. 05).结论 FK506可有效抑制PAN对足细胞的损伤作用,稳定α-actinin-4的表达,为临床应用FK506治疗肾小球疾病提供依据.