积雪草苷对足细胞α-actinin-4、synaptopodin蛋白及ERK/JNK通路的影响

目的:探讨积雪草苷对阿霉素诱导的足细胞中α-actinin-4、synaptopodin蛋白及ERK/JNK通路的影响。方法:1)MTT法检测积雪草苷对足细胞及阿霉素诱导的足细胞活力的影响。2)选用1μmol/L阿霉素制造足细胞损伤模型,蛋白印迹法(Western blotting)检测足细胞α-actinin-4、synaptopodin蛋白表达。3)免疫荧光检测足细胞骨架及Western blotting检测ERK/JNK信号通路的磷酸化水平。结果:1)低浓度积雪草苷(10~80μg/mL)对足细胞活力无明显影响,而高浓度积雪草苷(>80μg/mL)可降低足细胞活力;2)阿霉素体外可损伤足细胞,降低足细胞活力;积雪草苷浓度依赖性地减轻阿霉素对足细胞的损伤,增加足细胞活力;阿霉素体外可增加足细胞骨架蛋白α-actinin-4的表达,减少足细胞骨架蛋白synaptopodin的表达,而积雪草苷可下调阿霉素诱导的足细胞α-actinin-4蛋白表达,上调阿霉素抑制的足细胞synaptopodin的表达;3)阿霉素(1μmol/L)能升高ERK、JNK的磷酸化水平,与空白对照组比较差异有统计学意义(P<0.05);积雪草苷预处理细胞后,能够有效遏制阿霉素诱导的ERK活化,与模型对照组比较差异有统计学意义(P<0.05),但却不能抑制阿霉素诱导的JNK信号通路中JNK的活化。结论:积雪草苷预处理细胞后可能通过遏制阿霉素诱导的ERK信号通路的活化,减少阿霉素对足细胞骨架的损伤作用,从而改变了α-actinin-4、synaptopodin蛋白表达。

氯沙坦对晚期糖基化终产物诱导足细胞α-actinin-4表达的干预作用

目的观察晚期糖基化终产物(AGEs)对足细胞α-actinin-4的影响及氯沙坦的干预作用。方法不同浓度的AGEs(0,20,40,80μg/mL)干预足细胞24 h后,采用免疫印迹法检测足细胞α-actinin-4的表达。通过激光共聚焦显微镜观察足细胞肌动蛋白F-actin和α-actinin-4的分布,并在氯沙坦预处理足细胞后,观察α-actinin-4和F-actin的改变。结果与对照组相比,AGEs(80μg/mL)可明显降低足细胞α-actinin-4的表达[(62±13)%vs.100%,P<0.05],使α-actinin-4由膜周分布转为核周分布,并使肌动蛋白F-actin发生重构,而氯沙坦预处理可减轻AGEs介导的α-actinin-4的下调[(80±14)%vs.(62±13)%,P<0.05]和α-actinin-4和F-actin的重构,P<0.05。结论 AGEs可下调α-actinin-4表达,介导骨架蛋白的重构,而氯沙坦可减轻AGEs介导的这些改变。

KLF4通过mTOR/P70S6K途径激活细胞自噬减轻高糖诱导的足细胞损伤

目的:分析Krüppel样转录因子4(KLF4)对高糖诱导的足细胞损伤的影响及相关分子机制。方法:体外培养MPC5细胞,将MPC5细胞分为对照组(Control组)、高糖组(HG组)、高糖+空载质粒对照组(HG+NC组)、高糖+KLF4过表达组(HG+KLF4组)。采用qRT-PCR法检测细胞中KLF4 mRNA表达水平,CCK-8法测定细胞增殖活性,流式细胞术检测细胞凋亡,Western blot法检测细胞中相关蛋白表达水平。结果:与Control组比较,HG组MPC5细胞中KLF4 mRNA和蛋白表达量降低,细胞增殖活性降低,细胞凋亡率升高,细胞中突触足蛋白(synaptopodin)、足蛋白(podocin)、肾蛋白(nephrin)、微管相关蛋白轻链3-Ⅱ(LC3-Ⅱ)、Beclin1蛋白表达量降低,P62蛋白表达量、磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)/mTOR和磷酸化核糖体40S小亚基S6蛋白激酶(p-P70S6K)/P70S6K比值升高;差异均有统计学意义(P<0.05)。与HG组比较,HG+KLF4组MPC5细胞中KLF4 mRNA和蛋白表达量升高,细胞增殖活性升高,细胞凋亡率降低,细胞中synaptopodin、podocin、nephrin、LC3-Ⅱ、Beclin1蛋白表达量升高,P62蛋白表达量、p-mTOR/mTOR和p-P70S6K/P70S6K比值降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:KLF4通过激活足细胞自噬减轻高糖诱导的足细胞损伤,其作用机制可能与调控mTOR/P70S6K信号通路有关。

榛花消肾安胶囊干预实验性糖尿病大鼠足细胞相关蛋白α-actinin-4的研究

[目的]通过实验观察实验性糖尿病(DM)大鼠的肾脏及足细胞相关蛋白α-actinin-4的表达,表明"榛花消肾安胶囊"治疗糖尿病肾病的有效性。[方法]建立链脲佐菌素(STZ)诱导的实验性糖尿病大鼠模型分为DM模型组、对照组、中药组、西药组,中药组给予榛花消肾安胶囊,西药组给予厄贝沙坦片;检测空腹血糖、24 h尿微量白蛋白、血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN),应用光学显微镜和透射电镜及免疫组化方法观察足细胞骨架蛋白α-actinin-4的表达;应用实时定量聚合酶链反应(PCR)技术检测α-actinin-4 m RNA表达。[结果]中药干预之后中药高、中、低剂量组及西药对照组尿量较DM模型组明显减少(P<0.01);中药各剂量组与西药对照组大鼠血糖均明显低于DM模型组(P<0.01);中药各剂量组和西药对照组大鼠α-actinin-4及m RNA含量均低于DM模型组(P<0.01)。[结论]榛花消肾安胶囊能够降低实验性DM大鼠血糖、Scr、BUN,减少尿微量白蛋白的排泄,而改善肾功能;能够抑制实验性DM大鼠早期肾脏体积增大,而抑制α-actinin-4蛋白表达及其m RNA的表达。

双氢青蒿素抑制TLR4/NF-κB信号通路对高糖刺激的足细胞功能障碍的改善作用

目的探究双氢青蒿素通过调控Toll样受体4(TLR4)/核因子-κB(NF-κB)信号通路对D-葡萄糖诱导的人肾小球足细胞(HGPC)炎症、增殖、迁移和侵袭的影响。方法体外培养HGPC细胞,将HGPC细胞分为对照组(5 mmol·L^(-1)D-葡萄糖)、高糖组(30 mmol·L^(-1)D-葡萄糖)和不同浓度双氢青蒿素组(30 mmol·L^(-1)D-葡萄糖+5、10、20、40μmol·L^(-1)双氢青蒿素),筛选出合适的双氢青蒿素作用浓度;随后将细胞分为对照组、高糖组、双氢青蒿素组(30 mmol·L^(-1)D-葡萄糖+20μmol·L^(-1)双氢青蒿素)、抑制剂组(30 mmol·L^(-1)D-葡萄糖+5μmol·L^(-1)NF-κB通路抑制剂BAY 11-7082)、双氢青蒿素+抑制剂组(30 mmol·L^(-1)D-葡萄糖+20μmol·L^(-1)双氢青蒿素+5μmol·L^(-1)BAY 11-7082)和双氢青蒿素+激活剂组(30 mmol·L^(-1)D-葡萄糖+20μmol·L^(-1)双氢青蒿素+1μmol·L^(-1)NF-κB通路激活剂Prostratin),干预24 h。细胞计数试剂盒细胞8(CCK-8)法检测细胞活力;酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测炎症因子白细胞介素(IL)-1β和IL-8的表达水平;5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷(EdU)法检测细胞的增殖能力;Transwell小室法检测细胞迁移和侵袭能力;蛋白免疫印迹(Western Blot)法检测细胞周期蛋白D1(CyclinD1)、基质金属蛋白酶9(MMP-9)和TLR4/NF-κB通路相关蛋白表达水平。结果CCK-8法检测结果显示20μmol·L^(-1)双氢青蒿素对D-葡萄糖HGPC细胞活力恢复效果最好,因此选择20μmol·L^(-1)双氢青蒿素用于后续实验。与对照组比较,高糖组细胞增殖率和CyclinD1蛋白相对表达量明显降低(P<0.05),炎症因子(IL-1β和IL-8)、迁移数、侵袭数、MMP-9、TLR4和磷酸化(p)-NF-κB p65蛋白相对表达量明显升高(P<0.05);双氢青蒿素组、抑制剂组、双氢青蒿素+抑制剂组及双氢青蒿素+激活剂组中双氢青蒿素和BAY11-7082明显抑制了D-葡萄糖对HGPC细胞的上述作用(P<0.05);与双氢青蒿素组比较,双氢青蒿素+抑制剂组中BAY11-7082增强了双氢青蒿素对D-葡萄糖诱导的HGPC细胞的作用(P<0.05),双氢青蒿素+激活剂组中Prostratin则削弱了双氢青蒿素对D-葡萄糖诱导的HGPC细胞的作用(P<0.05)。结论双氢青蒿素能抑制D-葡萄糖诱导的HGPC细胞迁移和侵袭,并促进其增殖,能有效改善D-葡萄糖刺激对HGPC细胞的炎症损伤,其作用机制可能与阻滞TLR4/NF-κB信号通路信号转导有关。

Nephrin,α-actinin-4在糖尿病大鼠肾组织中的表达及其与足细胞数目的相关性研究

目的:探讨糖尿病肾病发展过程中Nephrin及α-actinin-4的表达变化及其与足细胞数目的相关关系。方法:应用SD大鼠,建立1型糖尿病大鼠模型,分为糖尿病组及正常对照组,应用免疫组化及RT-PCR方法观察在糖尿病肾病发展过程中Nephrin,α-actinin-4蛋白及mRNA表达变化,以及应用WT-1来标记足细胞核,观察足细胞数目的变化。结果:8周时,糖尿病组Nephrin染色强度较正常组明显降低(P<0.05),12周时变化更为明显(P<0.01),糖尿病组α-actinin-4染色强度在两个时间点较正常组均明显增高(P<0.01),足细胞数目在两个时间点较正常组均明显减少。Nephrin表达与足细胞数目呈正相关(r=0.93,P=0.002 4),α-actinin-4表达与足细胞数目表达呈负相关(r=-0.923,P=0.008 6),而足细胞数目与尿蛋白呈负相关(r=-0.950 8,P=0.003 6)。结论:Nephrin,α-actinin-4的表达在糖尿病肾病发展过程中发生改变,此种改变与足细胞数目减少、尿蛋白的发生密切相关。

α-actinin-4在糖尿病肾病大鼠的表达及其与足细胞数目的相关性

目的:探讨糖尿病肾病发展过程中α-actinin-4的表达变化及其与足细胞数目的关系。方法:建立STZ诱导的糖尿病大鼠模型,应用免疫组化及RT-PCR方法观察在糖尿病肾病发展过程中α-actinin-4的蛋白及mRNA表达变化,以及应用WT-1来标记足细胞核,观察足细胞数目的变化。结果:8周时,糖尿病组染色强度较正常组明显增高(P<0.01),12周时变化更为明显(P<0.01)。α-actinin-4的mRNA的表达水平在各时间点与组化结果相同。8周时,糖尿病组足细胞数目较正常组明显降低(P<0.05),12周时变化更为明显(P<0.01)。α-actinin-4与足细胞数目呈负相关关系(r=-0.957,P<0.01),足细胞数目与尿蛋白呈负相关(r=-0.95,P<0.01)。结论:α-actinin-4在糖尿病肾病发展过程中表达增高,并与足细胞数目呈负相关,α-actinin-4的表达增高与尿蛋白的发生密切相关。

糖尿病足溃疡发生过程中氧化应激介导的细胞凋亡及骨形态发生蛋白4的调控作用研究进展

糖尿病足溃疡(DFU)是糖尿病(DM)致残、致死的严重并发症之一,目前尚无有效手段预防DFU的发生。DFU发病机制复杂,DM引起的氧化应激(OS)过度激活造成的细胞凋亡、血管组织损伤是DFU及多种DM并发症发病的关键。骨形态发生蛋白4(BMP-4)是本课题组前期筛选出来的DFU及DM患者血清差异蛋白,研究发现其与DFU发病过程中OS介导的内皮细胞凋亡密切相关,并且DM状态下BMP-4还具有促炎、导致内皮功能障碍等作用,均会导致DFU的发生、发展。因此靶向调节BMP-4,降低其过度表达可能是预防DFU的新策略。文章阐述了DM状态下活性氧(ROS)的过度释放等导致OS过度激活造成细胞凋亡、血管组织损伤,最终导致DFU发生的关键过程,以及BMP-4通过NADPH氧化酶(NOX1)等多种途径对其产生的调控作用。除此之外,还阐述了DM状态下,BMP-4通过激活炎症核转录因子κB(NF-κB)信号通路等多种方式导致的内皮功能障碍及血管组织损伤的过程,以期为DFU预防的相关研究提供参考方向。

miR-146a靶向TLR4对糖尿病所致足细胞能量代谢障碍的保护作用

目的探讨糖尿病肾病足细胞(podocyte)能量代谢的调控机制。方法购买人源肾足细胞,高糖诱导建立糖尿病体外模型,转染miR-146a mimic或pcDNA3.1-TLR4及其阴性对照物。qRT-PCR检测miR-146a与TLR4的表达。通过检测细胞外酸化率(ECAR)、检测糖酵解关键酶HK2的mRNA评估足细胞的糖酵解能力;通过JC-1荧光染色与ATP试剂盒检测了线粒体膜电位的变化以及ATP的含量。Starbase网站(https://starbase.sysu.edu.cn/)预测、双荧光素酶报告实验检测miR-146a与TLR4的靶向结合。结果高糖诱导的足细胞中miR-146a表达下调,TLR4表达上调,糖酵解能力下降,细胞膜电位下降,ATP产生减少;上调miR-146a的表达可以改善这种变化,而同时上调TLR4的表达则抑制了高表达miR-146a的改善作用。miR-146a靶向抑制TLR4的表达。结论糖尿病肾病足细胞中miR-146a低表达,促进了TLR4的表达,抑制了足细胞的糖酵解、膜电位及ATP的含量,最终导致足细胞的能量代谢障碍。

半枝莲总黄酮通过Smad4/PKM2/HIF-1α改善高糖诱导的足细胞损伤的机制研究

目的:观察半枝莲总黄酮(TF-SB)对高糖诱导的足细胞(MPC-5)损伤及Smad4/PKM2/HIF-1α信号通路的影响。方法:首先采用CCK8法分析TF-SB对MPC-5细胞的安全性及药效浓度。随后MPC-5分为空白组、模型组和TF-SB组,除空白组外,模型组和TF-SB组采用高糖诱导建立MPC-5细胞损伤模型,分别检测TF-SB对MPC-5细胞ATP、凋亡和ROS水平的影响,并采用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定细胞因子(IL-1β、TNF-α、MCP-1)含量,反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测糖酵解基因(GLU1、PFK1和HK1)表达丰度,蛋白质印迹法(Western blot)检测各组细胞Smad4/PKM2/HIF-1α信号通路中相关蛋白的表达水平;结果:与空白组相比,模型组MPC-5细胞ATP含量、GLU1、PKF1和HK1表达丰度显著下降,凋亡和ROS水平、IL-1β、TNF-α与MCP-1的含量均显著增加(P<0.01);与模型组相比,TF-SB组ATP含量、GLU1、PKF1和HK1表达丰度显著升高,凋亡和ROS水平、IL-1β、TNF-α与MCP-1的含量均显著降低(P<0.01)。此外,与空白组相比,模型组Smad4、HIF-1α蛋白表达及细胞核中PKM2表达显著升高,细胞质中PKM2表达显著降低(P<0.01);与模型组相比,TF-SB组Smad4、HIF-1α表达及细胞核中PKM2表达显著降低,而细胞质中PKM2表达显著升高(P<0.01);结论:TF-SB促进MPC-5细胞线粒体活性诱导糖酵解,进而抑制炎症的分泌,达到治疗糖尿病肾病的作用可能与通过抑制Smad4/PKM2/HIF-1α信号通路有关。

糖肾平对糖尿病肾病大鼠α-actinin-4表达及足细胞数目影响

目的：探讨糖肾平对糖尿病肾病（Diabetic nephropathy,DN）大鼠发病过程中足细胞表达的影响,及α-actinin-4的表达与足细胞数目和DN大鼠蛋白尿的相关性。方法：采取腹腔注射STZ诱导糖尿病肾病大鼠模型。测定大鼠24 h尿蛋白定量;应用免疫组织化学方法观察DN大鼠肾小球中α-actinin-4和WT-1表达情况。进一步设计体外细胞培养试验,采用Western blotting方法检测糖肾平对足细胞α-actinin-4和WT-1表达的影响。结果：糖肾平组大鼠24 h尿蛋白定量明显降低（P〈0.01）。与正常组相比,DN组大鼠肾组织中α-actinin-4蛋白表达水平明显降低（P〈0.01）,且α-actinin-4表达与尿蛋白呈负相关关系（r=-0.384,P〈0.05）。模型组足细胞数目较正常组明显降低（P〈0.01）,且α-actinin-4表达与足细胞数目呈正相关关系（r=0.498,P〈0.01）。糖肾平治疗后α-actinin-4的表达水平及足细胞数目均明显升高（P〈0.01）,且体外足细胞Western blotting实验结果与免疫组化结果一致。结论：α-actinin-4表达降低,足细胞数目减少。α-actinin-4表达与蛋白尿呈负相关,与足细胞数目呈正相关。糖肾平可能通过调控糖尿病肾病肾组织actinin-4蛋白表达,保护大鼠足细胞,进而降低24 h尿蛋白定量,起到保护糖尿病肾病肾功能及延缓病程进展的作用。

益气活血化湿方对被动型Heymann肾炎模型大鼠足细胞裂孔膜蛋白α-actinin-4和CD2AP的调节作用

目的探讨益气活血化湿方及其拆方对被动型Heymann肾炎(PHN)模型大鼠足细胞裂孔膜蛋白α-actinin-4和CD2AP的调节作用。方法取雄性Wistar大鼠,制备经典的PHN模型。将造模成功的大鼠随机分为模型组、环孢素组、益气活血化湿方全方组、益气方组、活血方组和化湿方组,另取正常大鼠为对照组。各药物组分别灌胃给予相应药液,对照组和模型组大鼠灌胃给予等量0.9%NaCl溶液,连续6周。分别于第0、2、4、6周对各只大鼠眼眶静脉丛采血,代谢笼收集24 h尿液。全自动生化分析仪检测血清样本白蛋白(Alb)、肌酐(SCr)、尿素氮(BUN)水平以及尿液样本24 h尿蛋白定量(UPRO)。干预结束后,取双侧肾脏。HE染色后光镜下观察肾组织形态学变化,透射电镜下观察肾小球基底膜、足细胞及足突的形态学变化。PCR和Western blot检测肾组织中α-actinin-4和CD2AP的mRNA及蛋白表达水平。结果①与对照组相比,模型组大鼠在各时间点UPRO和SCr水平均明显升高(P<0.05),Alb水平明显下降(P<0.05)。与模型组相比,环孢素组第4、6周UPRO水平明显下降(P<0.05),第2、4、6周Alb水平明显下降(P<0.05),但第2、4、6周SCr和BUN水平明显升高(P<0.05)。与模型组相比,全方组仅第6周UPRO水平明显下降(P<0.05)。与环孢素组相比,全方组第2、4、6周SCr和BUN水平明显降低(P<0.05)。②与对照组相比,模型组光镜下观察可见肾小球明显肿大,肾小球基底膜弥漫性增厚,毛细血管襻受压,部分肾小管上皮细胞肿胀;电镜下显示上皮细胞下大量电子致密物沉积,足突广泛融合或消失。与模型组相比,各药物干预组的肾小球病变程度均有减轻。③与对照组相比,模型组α-actinin-4 mRNA和蛋白表达水平显著升高(P<0.05),CD2AP mRNA和蛋白表达水平显著降低(P<0.05)。与模型组相比,环孢素组α-actinin-4 mRNA和蛋白表达水平显著下调(P<0.05),CD2AP mRNA和蛋白表达水平显著上调(P<0.05)。与模型组相比,全方组α-actinin-4蛋白表达水平显著下调(P<0.05)。④与模型组比较,各拆方组在各时间点的UPRO、Alb、SCr和BUN水平均无明显变化(P>0.05)。病理学观察显示各拆方组肾小球损伤程度较模型组明显减轻。与模型组相比,益气方组α-actinin-4 mRNA和蛋白表达水平显著下调(P<0.05),活血方组CD2AP mRNA和蛋白表达显著升高(P<0.05)。结论益气活血化湿方可明显降低PHN模型大鼠尿蛋白水平,减轻肾小球损伤,其机制可能与下调裂孔膜蛋白α-actinin-4表达、上调CD2AP表达有关。其拆方益气方具有抑制α-actinin-4表达的作用,活血方具有促进CD2AP表达的作用。

白蛋白过负荷对足细胞骨架蛋白α-actinin-4的影响

目的:观察足细胞损伤及药物干预后细胞骨架蛋白mRNA的变化,以进一步研究足细胞病的发病机制。方法:体外培养条件永生化小鼠足细胞,设立分组:对照组、足细胞损伤组(BSA 20mg/ml)、地塞米松组(地塞米松0.1umol/L+白蛋白20mg/ml),分别于12h、24h、48h检测足细胞内α-actinin4 mRNA表达变化。结果:足细胞损伤组足细胞内α-actinin4 mRNA水平随时间变化逐渐降低,地塞米松组先降低后升高。结论:地塞米松可以改善足细胞损伤后骨架蛋白α-actinin-4的mRNA表达的变化。

萆薢分清颗粒对阿霉素肾病大鼠足细胞podocalyxin、α-actinin-4的影响

目的探讨萆薢分清颗粒对阿霉素肾病大鼠蛋白尿及肾组织足细胞足糖萼蛋白(podocalyxin)、α-辅肌动蛋白-4(α-actinin-4)的影响。方法将60只SPF级SD大鼠,随机分为空白组12只和造模组48只,造模组大鼠采用分两次尾静脉注射的方法建立阿霉素肾病大鼠模型。造模成功后随机分为模型组、萆薢分清颗粒(6.56 mL/kg)组(中药组)、泼尼松组(6.3 mL/kg)、萆薢分清颗粒+泼尼松组(结合组)进行灌胃,空白组及模型组予以同等量生理盐水灌胃,每日1次,连续灌胃4周。给药结束后检测大鼠24 h尿蛋白定量(24 h-UTP)、血清总胆固醇(TC),白蛋白(ALB)水平;采用苏木素-伊红(HE)染色、马松(Masson)染色观察肾组织病理形态学变化,应用免疫组化法(IHC)及蛋白免疫印迹法(Western blot)检测大鼠肾组织中足细胞相关蛋白podocalyxin、α-actinin-4表达水平。结果空白组比较,模型组大鼠24 h-UTP、血清中TC显著升高(P<0.05);ALB显著降低(P<0.05);肾小球可见局灶节段性瘢痕形成,系膜细胞及系膜基质增生,肾小管空泡变性,管腔内可见蛋白管型,间质纤维细胞增生伴炎性细胞浸润;podocalyxin阳性表达明显减弱,α-actinin-4呈强阳性表达(P<0.05);podocalyxin蛋白表达量显著下降(P<0.05),α-actinin-4蛋白表达量显著升高(P<0.05)。与模型组比较,各治疗组24 h-UTP,血清TC水平均有不同程度的下降,ALB升高(P<0.05);肾小球及小管间质病变较轻,少许肾间质水肿、纤维化,伴有少量炎性细胞浸润;podocalyxin阳性表达增强,α-actinin-4阳性表达减弱(P<0.05);podocalyxin蛋白表达量显著升高(P<0.05),α-actinin-4蛋白表达量显著降低(P<0.05)。结论萆薢分清颗粒可通过上调podocalyxin、下调α-actinin-4表达水平,从多靶点修复受损的足细胞,减少尿蛋白排泄量,保护肾。

1,25-二羟维生素D_3对糖尿病肾病大鼠足细胞Angptl4、Desmin表达的影响

目的探讨1,25-二羟维维生素D3[1,25-(OH)_2D_3]对糖尿病肾病(DN)大鼠足细胞损伤的影响及其可能的机制。方法选择雄性SD大鼠30只,取其中22只采用一次性腹腔注射STZ的方法制备糖尿病模型,将造模成功的18只大鼠随机分为DN模型组(M组)、1,25-(OH)_2D_3干预组(D组)各9只,另将未造模的8只大鼠作为正常对照组(N组)。D组在DN模型建立后予1,25-(OH)_2D_30.1μg/(kg·d)灌胃,M组给予等量橄榄油灌胃,N组给予等量蒸馏水灌胃。均干预12周后,收集各组大鼠24 h尿液,采用双缩尿法测定24 h尿蛋白(24 h Upro),采用ELISA法测定尿血管生成素样蛋白4(Angptl4)水平。眼球取血,分离血清,采用全自动生化分析仪测定血BUN、SCr水平,采用ELISA法测定血Angptl4水平。取各组大鼠右肾组织,采用HE染色观察肾组织病理变化。取各组大鼠肾组织,分别采用免疫组化SP法、Western blotting法检测肾组织Angptl4、结蛋白(Desmin)蛋白表达。结果与N组相比,M组、D组24 h Upro、尿Angptl4、血BUN、Scr均升高,血Angptl4水平均降低(P均<0.05);与M组相比,D组24 h Upr、尿Angptl4、血BUN、Scr均降低,血Angptl4水平升高(P均<0.05)。病理检查示,M组可见毛细血管球肥大,肾小球基底膜部分增厚,系膜增生。电镜结果示,M组肾小球基底膜增厚、足突融合,D组肾脏病理改变较M组减轻。与N组相比,M组肾组织Angptl4、Desmin蛋白表达均上调(P均<0.05);与M组相比,D组肾组织Angptl4、Desmin蛋白表达均下调(P均<0.05)。结论 1,25-(OH)_2D_3可减轻DN大鼠的肾损伤,其机制可能与抑制足细胞分泌Angptl4、Desmin蛋白,从而发挥对肾小球足细胞的保护作用有关。

miR-29a-3p靶向组蛋白去乙酰化酶4对高糖诱导的小鼠足细胞损伤的影响

目的探讨微小RNA(miR)-29a-3p是否通过调控组蛋白去乙酰化酶(HDAC)4表达影响高糖诱导的小鼠足细胞损伤。方法体外培养小鼠肾脏足细胞系MPC5,饥饿处理后随机分为正常对照(NG)组、高糖刺激(HG)组,分别将miR-29a-3p mimic、miR-NC、HDAC4 siRNA及si-NC转染至HG组MPC5细胞中,采用qRT-PCR、Western印迹分别检测miR-29a-3p与HDAC4蛋白表达,采用流式细胞术检测MPC5细胞凋亡,采用Western印迹法检测足细胞损伤相关蛋白〔synaptopodin、结蛋白(desmin)〕及细胞凋亡蛋白(Bcl-2、Bax、酶切caspase-3)表达。双荧光素酶报告基因实验验证miR-29a-3p与HDAC4的靶向关系。通过将HDAC4过表达质粒与miR-29a-3p mimic共同转染入HG组MPC5细胞,用Western印迹法与流式细胞术分别检测足细胞损伤相关蛋白、细胞凋亡蛋白及细胞凋亡率。结果与NG组相比,HG组肾脏足细胞MPC5中miR-29a-3p表达水平、synaptopodin及Bcl-2蛋白表达均显著降低(均P<0.05),而HDAC4、desmin、Bax、酶切caspase-3蛋白表达水平及细胞凋亡率均明显升高(均P<0.05);转染miR-29a-3p mimic后,MPC5细胞中synaptopodin、Bcl-2蛋白表达均明显增加(均P<0.05),而desmin、Bax、酶切caspase-3蛋白表达及细胞凋亡率均明显降低(均P<0.05);抑制HDAC4表达可减轻高糖刺激肾脏足细胞MPC5损伤,抑制MPC5细胞凋亡;双荧光素酶报告基因验证HDAC4是miR-29a-3p的靶基因;转染HDAC4过表达后MPC5细胞凋亡率、desmin及促凋亡蛋白表达均明显升高(均P<0.05),synaptopodin及Bcl-2蛋白表达均明显降低(均P<0.05)。结论miR-29a-3p在高糖诱导的小鼠足细胞中表达水平降低,上调miR-29a-3p表达可通过抑制靶基因HDAC4表达进而抑制足细胞凋亡从而减轻高糖诱导的足细胞损伤。

雷公藤甲素通过抑制TLR4基因对糖尿病肾病足细胞的保护作用

目的:研究雷公藤甲素对糖尿病肾病足细胞的保护作用及作用机制。方法:体外培养永生化小鼠肾小球足细胞,以高糖刺激足细胞诱导足细胞损伤,雷公藤甲素进行干预,采用qRT-PCR技术和蛋白质印迹法检测雷公藤甲素对高糖诱导的足细胞中Toll样小体4(Toll-like receptor 4,TLR4)表达水平的影响,采用慢病毒感染过表达TLR4,qRT-PCR和蛋白质印迹法检测感染效果,噻唑蓝比色法(MTT)检测各组足细胞增殖能力,流式细胞仪检测各组足细胞凋亡情况;酶联免疫吸附法(ELISA)检测各组足细胞培养上清液中IL-6和TNF-α的含量。结果:qRT-PCR和蛋白质印迹法检测结果显示雷公藤甲素下调高糖诱导的足细胞中TLR4的表达;MTT结果显示雷公藤甲素增加高糖诱导的足细胞的增殖活力;流式细胞术检测结果显示雷公藤甲素抑制高糖诱导的足细胞凋亡;ELISA检测结果显示雷公藤甲素抑制高糖诱导的足细胞分泌IL-6和TNF-α;过表达TLR4逆转雷公藤甲素对高糖诱导的足细胞保护作用。结论:雷公藤甲素能够通过抑制TLR4对糖尿病肾病足细胞起保护作用。

肾病患者血管生成素样蛋白-4与人足细胞损伤的相关性研究

目的观察不同病理类型肾病患者血清及尿液血管生成素样蛋白-4(Angptl4)的表达与促细胞损伤的相关性,探讨其临床意义。方法选取肾穿刺活检患者193例,根据病理类型分为微小病变肾病组(MCD组,n=59)、膜性肾病组(MN组,n=46)、IgA肾病组(IgA-N,n=46),选取微小病变肾病完全缓解(MCD-CR组,n=42)作为对照组,检测各组血清及尿液Angptl4水平,并与24小时尿蛋白定量(24U-TP)、血清清蛋白(ALB)、三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC)、血肌酐(Scr)进行相关性分析;镜下观察肾组织病理改变。结果 MCD组、MCD-CR组血清Angptl4水平高于MN组、IgA-N组(P<0.05);MCD组、MN组尿液Angptl4水平高于MCD-CR组及IgA-N组(P<0.05)。血清Angptl4水平在MCD组中与24U-TP、TG呈正相关(P<0.05),与ALB呈负相关(P<0.05);尿液Angptl4水平在MCD组、MN组中与24U-TP、TG呈正相关(P<0.05),与ALB呈负相关(P<0.05),在IgA-N组中与24U-TP呈正相关(P<0.05)。IgA-N组肾小球基底膜空泡变性,系膜细胞和基质轻度增生,足细胞未见明显异常。与IgA-N相比,MN组、MCD组肾小球存在显著的足细胞增生、肿胀伴空泡变性。结论尿液Angptl4水平的高低反映了蛋白尿的严重程度,可能有助于评估早期的足细胞损伤。

雷公藤甲素对PAN致足细胞损伤中mTOR/p70S6K/4EBP1信号通路的影响

目的:探讨雷公藤甲素(triptolide,TP)对m TOR/p70S6K/4EBP1信号通路的影响及其保护足细胞的可能机制。方法:氨基核苷嘌呤霉素(puromycin aminonucleoside,PAN)刺激体外培养的足细胞24 h建立模型。细胞增殖检测试剂盒(CCK-8法)检测不同浓度雷公藤作用下PAN损伤足细胞的细胞存活率。后将足细胞随机分组:(1)对照组;(2)PAN组(PAN组,PAN 50μg/ml);(3)TP组(PAN 50μg/ml+TP 10 ng/ml),予以相应刺激24 h。采用实时荧光定量PCR检测足细胞m TOR、4EBP1、p70S6K、Akt、synaptopodin mRNA表达量,western blot检测足细胞p-mTOR、p-4EBP1、p-p70S6K、p-Akt、synaptopodin蛋白表达量。结果:(1)CCK-8结果显示,PAN造成足细胞损伤时加入浓度为3、10 ng/ml雷公藤甲素浓度均使足细胞活性上升,10 ng/ml时作用最明显(均P<0.05)。(2)PAN增加m TOR、4EBP1、p70S6K、Akt mRNA及蛋白的表达量,减少synaptopodin mRNA及蛋白表达水平(均P<0.05)。(3)雷公藤甲素共处理细胞后,m TOR、4EBP1、p70S6K、Akt mRNA及蛋白的表达水平明显下降,而synaptopodin mRNA及蛋白表达水平明显升高(均P<0.05)。结论:雷公藤甲素可能通过抑制m TOR/p70S6K/4EBP1信号通路,减轻足细胞损伤。

甘西鼠尾草总酚酸提取物对嘌呤霉素氨基核苷诱导损伤的足细胞中Toll样受体4表达的影响

目的:探讨SPE及其单体对嘌呤霉素氨基核苷(PAN)诱导的损伤足细胞中Toll样受体4(TLR4)通路表达的影响。方法:足细胞与含有甘西鼠尾草总酚酸提取物(SPE)、迷迭香酸(RA)、丹酚酸B(SalB)、RA+SalB混合及他克莫司的完全培养液预先孵育30 min,再加入PAN(100μg/ml)继续作用24 h,观察足细胞骨架结构F-actin变化,western blot及半定量RT-PCR检测足细胞中TLR4、myd88、phosphor-NF-κB(pp65)在蛋白及mRNA水平的表达量变化。结果:(1)PAN作用24 h后,足细胞骨架蛋白F-actin明显损伤,微丝解聚、胞体回缩,少数细胞尚存排列紊乱的丝状结构,而提前给予保护药物SPE、SalB、RA、SalB+RA混合药物及他克莫司组的足细胞损伤明显减弱。(2)western blot数据显示,PAN诱导的损伤足细胞中TLR4、myd88及pp65蛋白的表达与正常组相比均有明显上调(P<0.05);保护药物组:TLR4蛋白表达较模型组有明显下降(P<0.05);My D88蛋白表达除SalB高剂量组及SalB+RA低剂量组较模型组无显著下降外,其余均能明显下调其表达量(P<0.05);pp65在保护药物组中的表达均较模型对照组低(P<0.05)。(3)半定量RT-PCR结果显示,模型对照组中TLR4、My D88及NF-κB的mRNA表达量明显高于正常对照组;保护药物组中:TLR4 mRNA表达量在各药物处理组中均明显低于PAN组(P<0.05),其中的SPE高、低剂量组,RA高、低剂量组,SalB+RA高剂量组与正常组相接近(P>0.05);My D88 mRNA表达量在SPE及其单体处理后均有明显下调(P<0.05);NF-κB mRNA表达量除SalB高剂量组中无明显下调外(P>0.05),其余各保护药物组均下调(P<0.05)。结论:SPE及其活性单体对PAN诱导损伤足细胞的保护作用机制可能部分通过抑制TLR4信号相关蛋白表达来实现;甘西鼠尾草总酚酸提取物中的单体迷迭香酸对TLR4及其下游信号分子My D88、NF-κB的抑制作用优于丹酚酸B和混合给药组。