Nephrin,podocin及α-actinin在小鼠肾小球足细胞系的表达与分布

目的 :探讨nephrin ,podocin及α actinin在小鼠肾小球足细胞系 (MPC5)的表达与分布 ,为进一步研究上述分子间的相互作用建立稳定的实验平台。 方法 :培养小鼠MPC5,以γ 干扰素诱导在 33℃传代增生 ,继而在37℃培养两周使细胞分化成熟以用于实验研究。相差显微镜观察足细胞形态 ;免疫荧光染色观察nephrin ,podocin ,α actinin及WT1在足细胞的分布 ;RT PCR检测足细胞nephrin ,podocin及α actinin 4的mRNA ;免疫蛋白印迹检测nephrin ,podocin ,α actinin及WT1蛋白。 结果 :成熟足细胞呈星形且有突起形成。免疫荧光及免疫蛋白印迹显示足细胞特异性的表达WT1分子。免疫荧光染色可见nephrin和podocin在足细胞内均呈线状分布于胞膜表面 ,α actinin呈细丝状分布于胞质内及伸出的突起中。在mRNA水平及蛋白水平均检测到nephrin ,podocin和α actinin 4表达 ,其蛋白大小分别为 180KDa,4 5KDa和 10 0KDa。 结论 :首次在mRNA水平及蛋白水平证实了小鼠MPC5能够表达nephrin ,podocin及α actinin ,为进一步研究这些分子间的相互作用奠定了基础。

肾小球足细胞系的研究进展

足细胞足突间的裂孔隔膜是肾小球滤过屏障的关键组成部分 ,其成分的阐明使我们对蛋白尿发生机制的研究达到分子水平。足细胞是终末分化细胞 ,不再进行分裂增殖 ,足细胞系的建立为我们理解足细胞生物学及足细胞分子间作用和联系提供很好的研究平台。

干扰素α对乙型肝炎病毒X蛋白诱导小鼠足细胞系凋亡的影响及分子机制研究

目的观察干扰素α(INF-α)对乙型肝炎病毒X (HBx)蛋白诱导的小鼠足细胞系(MPC5)凋亡的影响及其分子机制。方法以携带HBx基因的pEX质粒转染MPC5细胞,采用逆转录PCR检测不同时间点HBx mRNA表达水平。将MPC5细胞分为对照组:正常条件下培养的MPC5细胞;INF-α组:正常MPC5细胞与INF-α共培养;HBx组:HBx诱导的MPC5细胞;HBx+INF-α组:HBx诱导的MPC5细胞与INF-α共培养。不同实验条件下干预48 h后,采用流式细胞术检测各组MPC5细胞凋亡情况;采用实时荧光定量PCR法和Western blot法检测足细胞裂孔隔膜相关蛋白(nephrin、CD2AP、synaptopodin)和细胞骨架相关蛋白(TRPC6)的mRNA及其蛋白的表达。结果 pEX-HBx转染MPC5细胞后48 h HBx mRNA表达最高(P < 0.05)。HBx组MPC5细胞凋亡率显著高于对照组、INF-α组和HBx+INF-α组(P < 0.05)。与对照组和INF-α组相比,HBx组nephrin、synaptopodin、CD2AP mRNA及其蛋白的表达水平明显降低,TRPC6 mRNA及其蛋白的表达水平明显增高(P < 0.05)。与HBx组相比,HBx+INF-α组nephrin、synaptopodin、CD2AP mRNA及其蛋白的表达水平明显增高,TRPC6 mRNA及其蛋白的表达水平明显降低(P < 0.05)。结论 INF-α可抑制HBx诱导的MPC5细胞凋亡,其机制可能与INF-α可调节HBx诱导的足细胞裂孔隔膜相关蛋白(CD2AP、nephrin、synaptopodin)和细胞骨架相关蛋白(TRPC6)的异常表达恢复正常有关。

嘌呤霉素损伤小鼠肾小球足细胞系中podocin表达与分布的影响及其意义

目的Podocin是构成肾小球足细胞裂孔隔膜(slit diaphragm,SD)完整性的重要分子,其表达异常与大量蛋白尿的形成有关。本研究采用体外培养肾小球足细胞系,探讨足细胞损伤过程中,podocin mRNA表达和分布变化与足细胞损伤的关系。方法将体外培养的足细胞采用随机数字表法设立为实验组与对照组。实验组采用嘌呤霉素(puromycin aminonucleoside,PAN)刺激(剂量为50μg/mL),分别于8 h,24 h和48 h观察细胞形态、提取总RNA和细胞免疫组化观察podocin的分布。对照组用含10%FBS的RPMI 1640培养液培养。细胞图像应用Image J图像处理软件,计算实验组与对照组在上述各时间点200倍镜下随机选择的30个细胞的相对面积,半定量RT-PCR和间接免疫荧光法检测podocin mRNA表达和分布变化。结果对照组呈星形伸出树枝状突起,相邻细胞间形成相互连接。实验组细胞体缩小,足突回缩、消失,细胞间失去相互连接。上述各时间点两组间podocin mRNA表达比较,差异无显著意义(P>0.05)。Podocin在对照组呈细丝状均匀分布于细胞核膜、细胞质及细胞膜;在实验组主要沿细胞核膜呈点线样分布,刺激后8 h和24 h细胞质有少许分布,刺激48 h后出现细胞膜、细胞质分布缺失。结论Podocin分布异常与足细胞损伤密切相关,损伤早期即有变化;podocin分布异常是足细胞损伤过程中的重要分子效应。