足细胞裂孔隔膜相关蛋白分子研究进展

肾小球滤过屏障可以阻止血浆蛋白进入尿液,由血管内皮细胞、肾小球基底膜和足细胞（足突）构成。而足细胞足突间的裂孔隔膜（slit diaphragm,SD）是构成肾小球滤过屏障结构及功能完整性的最重要组成部分,亦是限制蛋白滤过的关键部位。近年随着对肾小球滤过屏障机制的深入研究,已发现多种重要的足细胞相关蛋白。本文就足细胞具有代表性的几类相关蛋白结构特征、功能做一综述。

雷公藤内酯醇对小鼠肾小球足细胞裂孔隔膜核心蛋白表达干预作用的研究

目的观察雷公藤内酯醇(TP)干预高糖环境培养的小鼠肾小球足细胞裂孔隔膜nephrin、podocin和CD2AP的表达,探讨雷公藤治疗糖尿病肾病(DN)蛋白尿的分子生物学机制。方法培养成熟的小鼠足细胞随机分为对照组1、对照组2、高糖组和TP干预组,TP干预组进一步分为低剂量、中剂量和高剂量组。用不同浓度的TP(8、16和32ng/ml)干预高糖(25mmol/L的Glu)培养24h后的小鼠足细胞,用RT-PCR法检测干预前后nephrin、podocin和CD2AP mRNA的表达;用间接免疫荧光法检测16ng/ml TP干预后nephrin和podocin蛋白的表达。结果(1)与对照组相比,高糖诱导的足细胞nephrin、podocin和CD2AP mRNA表达均明显减弱(均P<0.01)。(2)TP显著上调高糖诱导的足细胞nephrin、podocin和CD2AP mRNA的表达(均P<0.05)。(3)16ng/ml TP能明显上调高糖对足细胞nephrin和podocin(均P<0.05)蛋白表达的抑制。结论 TP显著上调高糖诱导的足细胞nephrin、podocin和CD2AP的表达,可能是其降低DN蛋白尿的机制之一。

中药对肾脏足细胞细胞骨架及裂孔隔膜相关蛋白的研究进展

肾小球内有三种固有细胞：系膜细胞、内皮细胞、足细胞。不同的病因可导致不同固有细胞的损伤，在临床上表现为不同类型的。肾小球疾病。其中足细胞受损后，临床主要表现为蛋白尿。蛋白漏出是肾小球疾病的常见表现，反过来也是加速。肾小球硬化的一个重要因素。近年来对足细胞生物学研究的深入，足细胞已被认为是参与各种原发或继发性肾小球疾病进展的关键细胞。本文对近5来中医药对足细胞的治疗研究进行汇总，希望为中医药对足细胞的研究提供思路。

肾脏足细胞裂孔隔膜的分子组成

足细胞裂孔隔膜结构的改变是导致肾小球疾病产生蛋白尿的主要原因 ,已陆续发现包括nephrin在内的与裂孔隔膜相关的多个蛋白分子 ,如ZO 1,CD2AP ,P cadherin ,podocin ,NEPH1,FAT及Filtrin等 ,它们的存在及相互作用对于保证裂孔隔膜的完整性和滤过功能有着直接或间接的作用 ,这些蛋白分子的发现有利于进一步阐明蛋白尿的发病机制 。

足细胞分子分布和表达与足突形态变化和蛋白尿发生的关系

目的 :探讨裂孔隔膜分子nephrin、podocin和足细胞骨架蛋白α actinin及足突形态变化与蛋白尿发生的关系。方法 :建立嘌呤霉素 (PAN)大鼠肾病模型 ,用体视学方法检测足突形态改变 ;用免疫荧光染色、图像分析和实时定量PCR方法动态观察PAN注射后不同时间点各分子蛋白及mRNA表达量及分布变化。结果 :蛋白尿出现前 ,PAN注射 2d时 ,足突肿胀、nephrin和podocin分布改变、podocin蛋白减低 ;5d时 ,上述改变进一步加重、nephrin蛋白及mRNA表达量下降。第 1 0天尿蛋白显著升高 [(1 30 .8± 30 .7)mg/d ,P =0 .0 2 ],足突弥漫融合、nephrin和 podocin分布明显异常、蛋白表达量显著减低、mRNA表达量回复至对照组水平。蛋白尿恢复时 ,足突形态学指标明显恢复、podocin蛋白水平回复至对照组水平、nephrin蛋白水平仍低于对照组、α actinin蛋白水平显著增加伴分布异常。nephrin和 podocin蛋白表达量与足突体积密度呈负相关 (rnephrin=- 0 .78,P =0 .0 0 0 1 ;rpodocin= - 0 .76 ,P =0 .0 0 0 1 )。结论 :足突肿胀、足细胞分子nephrin、podocin分布异常及 podocin蛋白表达量减低发生在蛋白尿发生前 ,提示nephrin和

黄芪甲苷对糖尿病肾病大鼠足细胞裂孔隔膜的保护作用

目的:探讨黄芪甲苷对糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)大鼠足细胞裂孔膈膜的保护作用及其可能机制。方法:利用腹腔注射链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)建立糖尿病大鼠模型。将40只雄性SD大鼠随机分为4组各10只:正常对照组(NC组)、黄芪甲苷组(astragaloside Ⅳ,AS-Ⅳ组)、糖尿病肾病组(DN组)和糖尿病肾病+黄芪甲苷干预组(DN+AS-Ⅳ组)。造模成功后每6、12周检测大鼠体质量及24小时尿蛋白量。造模后12周末留取大鼠血样本和肾组织标本并处死大鼠。检测大鼠肌酐(serum creatinine,SCr)、尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)和尿蛋白;PAS及Masson染色观察肾脏病理改变;电镜观察足细胞超微结构变化;免疫组化法及Western Blot法检测肾组织Nephrin、Podocin、Desmin表达。结果:与DN组相比黄芪甲苷可明显降低大鼠蛋白尿,改善大鼠肾脏病理损伤。DN组Nephrin、Podocin蛋白表达量均低于NC组(P<0.05),Desmin蛋白表达量高于NC组(均P<0.05),AS-Ⅳ组肾脏病理改变及各指标明显改善,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:黄芪甲苷可能通过稳定足细胞裂孔隔膜蛋白Nephrin和Podocin来抑制STZ诱导的糖尿病大鼠肾脏损伤。

中药有效成分对糖尿病肾病足细胞裂空隔膜蛋白干预作用的研究进展

肾小球足细胞裂孔隔膜(SD)蛋白是SD的重要组成成分,其在维持SD结构和功能的完整性方面发挥着关键性作用,并且与蛋白尿的发生密切相关。从中药中提取有效成分对SD蛋白的结构、功能及其作用机制进行干预,已成为防治糖尿病肾病研究的一个热点。本文就近年来足细胞SD蛋白的研究现状、中药有效成分对SD蛋白的干预作用及其作用机制作一综述,主要阐述了雷公藤、黄芪、积雪草、川芎、绞股蓝、三七、冬虫夏草、红参、五味子等多种中药的有效成分对SD蛋白,尤其是nephrin、podocin蛋白等的干预作用及其防治蛋白尿的作用机制,为更好地设计早期蛋白尿防治方案以及为预防肾病综合征提供新的研究策略。

Rho GTPases对肾小球足细胞特异性裂孔膜骨架蛋白的调控作用

肾小球足细胞是一种呈高度分化、具有独特结构和功能的上皮细胞,且是构成肾小球滤过膜的重要结构之一。足突的形态变化对于维持足细胞的正常生理功能尤其重要,而前者与肌动蛋白的排列密切相关。Rho GTPases参与多种细胞生命活动,在细胞骨架的调控中发挥核心作用。因此,本文就Rho GTPases对足细胞特异性裂孔膜(slit diaphragms,SD)骨架蛋白的调控作用进行综述。

肾衰饮对糖尿病肾病大鼠足细胞标志蛋白、足细胞裂孔膜蛋白影响

目的研究肾衰饮对糖尿病肾病(DKD)大鼠足细胞标志蛋白(PCX)、足细胞裂孔膜蛋白(Nephrin)的影响。方法选取SPF级雄性SD大鼠72只随机分为空白组、DKD组、厄贝沙坦组、肾衰饮低剂量组、肾衰饮中剂量组、肾衰饮高剂量组。采用高脂高糖饲料喂养联合链脲佐菌素腹腔注射建立DKD大鼠模型。厄贝沙坦组采用厄贝沙坦2.7 mg/mL灌胃;肾衰饮低、中、高剂量组分别采用肾衰饮2.79、5.58、11.16 g/mL灌胃;空白组、DKD组采用等体积生理盐水灌胃。连续给药8周后检测各组大鼠尿蛋白(PRO)、总胆固醇(TC)、血肌酐(Scr)、甘油三酯(TG)、血尿素氮(BUN)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、葡萄糖(GLU)、谷丙转氨酶(ALT)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、谷草转氨酶(AST)含量;苏木素-伊红(HE)染色观察肾脏组织病理形态学变化;酶联免疫吸附试验检测血清碱性纤维母细胞生长因子(bFGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)表达水平;蛋白免疫印迹法检测肾脏组织PCX、Nephrin蛋白表达水平。结果与空白组比较,DKD组大鼠GLU、ALT、AST、PRO、Scr、BUN、TC、TG、LDL-C水平显著升高,HDL-C水平显著下降(P<0.01);肾小球发生硬化性改变、上皮细胞颗粒样变性、囊腔明显变窄,肾小管周围大量炎性细胞浸润;血清bFGF、IGF、MCP-1表达水平显著升高(P<0.01);PCX、Nephrin水平显著降低(P<0.01)。与DKD组比较,厄贝沙坦组和肾衰饮各剂量组大鼠GLU、ALT、AST、PRO、Scr、BUN、TC、TG、LDL-C水平显著降低,HDL-C水平显著上升(P<0.05,P<0.01);肾脏病理损害不同程度减轻;厄贝沙坦组、肾衰饮高剂量组大鼠血清bFGF、IGF、MCP-1表达水平均有不同程度下降(P<0.01);厄贝沙坦组、肾衰饮高剂量组大鼠PCX、Nephrin水平均有不同程度上升(P<0.05,P<0.01)。结论肾衰饮能够有效降低DKD大鼠血糖、血脂、肝功能、肾功能、蛋白尿水平,抑制血清bFGF、IGF、MCP-1表达,改善肾组织病理改变,其机制可能与上调PCX、Nephrin蛋白表达以修复足细胞损伤有关。

化瘀通络中药对高糖刺激下足细胞裂孔膜蛋白的干预作用

通过化瘀通络中药对H-2Kb-ts A58条件性永生化小鼠足细胞裂孔膜蛋白podocin、CD2AP表达的干预作用,探讨化瘀通络中药降低糖尿病肾病蛋白尿、保护肾功能的可能作用机制。实验以体外培养小鼠足细胞为研究对象,将其分为正常糖组(CG)、高糖组(HG)、高糖加药组(HG+Z),通过免疫细胞化学(ICC)、蛋白质印迹法(Western-Blot)、实时荧光定量(Real-time PCR)方法检测不同时间点不同干预后各组podocin、CD2AP蛋白及基因的表达情况。结果显示干预足细胞48 h后,与CG组比较,其余两组podocin、CD2AP两种蛋白表达量均明显降低(P<0.05,P<0.01);与HG组比较,(HG+Z)组两种蛋白表达量均明显升高(P<0.05)。与同时间点CG组比较,其余两组podocin、CD2AP mRNA表达均显著降低(P<0.01);与同时间点HG组比较,(HG+Z)组48 h两种蛋白的基因表达量均明显升高(P<0.01),24、72 h与同时间点HG组无明显差异(P>0.05)。以上结果说明化瘀通络中药可以上调高糖刺激下足细胞裂孔膜蛋白podocin、CD2AP的表达,其可能为化瘀通络中药减少糖尿病肾病蛋白尿、保护肾功能的作用机制之一。

ROS介导棕榈酸诱导的肾小球足细胞骨架及裂孔隔膜损伤

目的:探讨棕榈酸(palmitic acid,PA)对足细胞肌动蛋白纤维骨架及裂孔隔膜蛋白损伤的影响。方法:应用PA刺激体外培养的条件永生性小鼠肾小球足细胞株,分为对照组(1%BSA)和PA(150μmol/L)组。采用Alexa 549-phalloidin染色观察足细胞肌动蛋白纤维骨架的变化;免疫荧光染色法观察检测足细胞裂孔隔膜蛋白Nephrin和Podocin的表达;油红“O”、透射电镜以及BODIPY染色检测PA刺激下足细胞内脂质积聚情况。应用不同浓度PA刺激足细胞,分为对照组(1%BSA)、50μmol/L PA组、150μmol/L PA组、300μmol/L PA组。采用Western blot检测足细胞裂孔隔膜蛋白Nephrin和Podocin的表达。进一步应用氧自由基清除剂N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl cysteine,NAC)预处理足细胞,分为对照组(1%BSA)、PA(150μmol/L)组、NAC组、PA(150μmol/L)+NAC组。采用DCFH-DA染色检测细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)产生;Alexa 549-phalloidin染色观察足细胞肌动蛋白纤维骨架的变化;Western blot检测足细胞裂孔隔膜蛋白Nephrin和Podocin的表达。结果:Western blot结果示300μmol/L PA组足细胞内Nephrin和Podocin的表达(0.360±0.030,0.900±0.040)分别与对照(Ctr)组(1.000±0.030,1.000±0.030)和50μmol/L PA组(0.912±0.020,0.900±0.040)相比都明显减少(P=0.000,P=0.000;P=0.000,P=0.003)。免疫荧光显示与Ctr组相比,PA组足细胞Nephrin(t=6.014,P=0.010)和Podocin(t=6.171,P=0.010)蛋白的表达减少。使用NAC预处理足细胞清除ROS,与PA组(1.21±0.04,1.30±0.03)相比,PA+NAC组Nephrin(2.87±0.05)和Podocin(2.69±0.06)的表达减少(P=0.000,P=0.000)。结论:ROS介导了棕榈酸诱导的足细胞骨架及裂孔隔膜损伤。

益气活血化湿方对被动型Heymann肾炎模型大鼠足细胞裂孔膜蛋白α-actinin-4和CD2AP的调节作用

目的探讨益气活血化湿方及其拆方对被动型Heymann肾炎(PHN)模型大鼠足细胞裂孔膜蛋白α-actinin-4和CD2AP的调节作用。方法取雄性Wistar大鼠,制备经典的PHN模型。将造模成功的大鼠随机分为模型组、环孢素组、益气活血化湿方全方组、益气方组、活血方组和化湿方组,另取正常大鼠为对照组。各药物组分别灌胃给予相应药液,对照组和模型组大鼠灌胃给予等量0.9%NaCl溶液,连续6周。分别于第0、2、4、6周对各只大鼠眼眶静脉丛采血,代谢笼收集24 h尿液。全自动生化分析仪检测血清样本白蛋白(Alb)、肌酐(SCr)、尿素氮(BUN)水平以及尿液样本24 h尿蛋白定量(UPRO)。干预结束后,取双侧肾脏。HE染色后光镜下观察肾组织形态学变化,透射电镜下观察肾小球基底膜、足细胞及足突的形态学变化。PCR和Western blot检测肾组织中α-actinin-4和CD2AP的mRNA及蛋白表达水平。结果①与对照组相比,模型组大鼠在各时间点UPRO和SCr水平均明显升高(P<0.05),Alb水平明显下降(P<0.05)。与模型组相比,环孢素组第4、6周UPRO水平明显下降(P<0.05),第2、4、6周Alb水平明显下降(P<0.05),但第2、4、6周SCr和BUN水平明显升高(P<0.05)。与模型组相比,全方组仅第6周UPRO水平明显下降(P<0.05)。与环孢素组相比,全方组第2、4、6周SCr和BUN水平明显降低(P<0.05)。②与对照组相比,模型组光镜下观察可见肾小球明显肿大,肾小球基底膜弥漫性增厚,毛细血管襻受压,部分肾小管上皮细胞肿胀;电镜下显示上皮细胞下大量电子致密物沉积,足突广泛融合或消失。与模型组相比,各药物干预组的肾小球病变程度均有减轻。③与对照组相比,模型组α-actinin-4 mRNA和蛋白表达水平显著升高(P<0.05),CD2AP mRNA和蛋白表达水平显著降低(P<0.05)。与模型组相比,环孢素组α-actinin-4 mRNA和蛋白表达水平显著下调(P<0.05),CD2AP mRNA和蛋白表达水平显著上调(P<0.05)。与模型组相比,全方组α-actinin-4蛋白表达水平显著下调(P<0.05)。④与模型组比较,各拆方组在各时间点的UPRO、Alb、SCr和BUN水平均无明显变化(P>0.05)。病理学观察显示各拆方组肾小球损伤程度较模型组明显减轻。与模型组相比,益气方组α-actinin-4 mRNA和蛋白表达水平显著下调(P<0.05),活血方组CD2AP mRNA和蛋白表达显著升高(P<0.05)。结论益气活血化湿方可明显降低PHN模型大鼠尿蛋白水平,减轻肾小球损伤,其机制可能与下调裂孔膜蛋白α-actinin-4表达、上调CD2AP表达有关。其拆方益气方具有抑制α-actinin-4表达的作用,活血方具有促进CD2AP表达的作用。

三芪口服液影响单侧肾切除糖尿病大鼠足细胞及裂孔膜相关分子表达研究

【目的】观察三芪口服液对单侧肾切除糖尿病(DM)大鼠足细胞及裂孔隔膜蛋白分子(Nephrin、Podocin、CD2AP)表达的影响,探讨其肾脏保护的作用机制。【方法】选用雄性SD大鼠,随机分为假手术组、模型组、中药组,采用以单侧肾切除,配合小剂量链脲佐菌素(STZ,剂量35 mg/kg)腹腔注射方法复制单侧肾切除DM大鼠模型;各组分别给予三芪口服液(剂量为2.5 g·kg-1·d-1)及等容积蒸馏水灌胃,干预8周;测量足细胞密度及足突宽度等变化,应用免疫组织化学技术观察各组大鼠肾组织Nephrin、Podocin、CD2AP蛋白表达改变。【结果】中药组大鼠足细胞密度增加,足突病变较轻;肾组织Nephrin、Podocin、CD2AP蛋白表达较模型组显著增加(P<0.05或P<0.01)。【结论】三芪口服液对单侧肾切除DM大鼠的肾脏保护作用可能与减轻足细胞损伤,调节足细胞Nephrin、Podocin、CD2AP的蛋白表达有关。

足糖萼蛋白是神经发育中具有多重功能的多聚唾液酸化神经细胞黏附分子

足糖萼蛋白（Podocalyxin,PC）是肾小球足细胞顶端表面表达的主要糖蛋白。它带有很强的负电荷,已有研究表明PC有抗黏附作用从而维持滤过缝隙的开放。PC缺失的小鼠因为肾脏发育缺陷，突变型足细胞不能形成足突，导致肾小球渗透性降低和无尿，因此在出生不久后死亡。

miR-155表达变化对TGF-β1损伤足细胞蛋白podocin、CD2AP、synaptopodin的影响

目的:研究miR-155 mimics/inihibitor转染足细胞后微小RNA-155(miR-155)的表达变化及其对TGF-β1损伤足细胞的影响。方法:体外培养小鼠足细胞,细胞免疫荧光染色鉴定足细胞分化成熟;用TGF-β1处理足细胞构建足细胞损伤模型,RT-PCR和Western blot分别检测miR-155和CD2AP的表达;免疫荧光显微镜观察转染成功指示剂Cy3,RT-PCR检测miR-155 mimics/miR-155 inihibitor转染(0 h、24 h、48 h、72 h)后miR-155的表达;选取转染时间48~72 h,RT-PCR检测Normal、TGF-β1、TGF-β1+mimics、TGF-β1+mimics NC、TGF-β1+inhibitor、TGF-β1+inhibitor NC组细胞miR-155及podocin、CD2AP、synaptopodin的mRNA表达,Western blot检测3种蛋白的表达,免疫荧光观察各组CD2AP的荧光分布和表达。结果:CD2AP呈足细胞分化成熟的特征分布;TGF-β1干预后miR-155表达上升,CD2AP蛋白表达下降(P<0.05);miR-155 mimics或miR-155 inihibitor转染48 h、72 h后,miR-155表达明显增加或减少(P<0.05);miR-155 mimics可上调TGF-β1诱导的miR-155表达(P<0.05),且可促进TGF-β1诱导的足细胞podocin、CD2AP、synaptopodin的mRNA和蛋白表达下降(P<0.05),而转染miR-155 inihibitor对足细胞蛋白的作用与miR-155 mimics相反。免疫荧光结果显示CD2AP蛋白的表达与Western blot、RT-PCR结果一致。结论:miR-155可靶向足细胞蛋白podocin、CD2AP和synaptopodin的表达,miR-155过表达可促进足细胞损伤,miR-155表达下调则可改善足细胞的损伤,因此,miR-155可作为足细胞损伤新的药物靶标。