完全横断性脊髓损伤后跨神经元变性的实验研究

目的:探讨大鼠完全性脊髓损伤后损伤平面以下下运动神经元轴突参与组成的周围神经的变化及其变化规律,为临床治疗、康复及预后的判断提供相关的理论基础。方法:48只成年雄性Wistar大鼠随机分为假手术组和脊髓损伤组,各组24只,每组均对应分为7d、1个月、2个月、3个月4个时间点,每组每个时间点6只大鼠。完全性脊髓损伤组大鼠制作T10水平完全性脊髓横断模型。在预定取材时间点处死相应动物,自腓总神经入肌点处向近端切取10mm该神经,分别行天青美-蓝染色光镜观察及超微结构观察。结果:各时间点假手术组腓总神经光镜下观察,神经纤维排列均匀;轴突外形正常、染色均匀。超微结构观察,髓鞘外形正常,板层清晰;轴索位置正常,轴索内微丝微管正常。完全性脊髓损伤组光镜观察发现腓总神经髓鞘和轴索出现明显退变,且退变随时间推移逐渐加重,同时出现轴突发芽现象。超微结构观察可见轴索内线粒体肿胀,轴浆内微丝、微管溶解,髓鞘板层结构破坏,雪旺氏细胞增生及空泡变性现象。退变的同时,腓总神经出现大量的新生神经纤维即轴突发芽现象。结论:完全性横断性脊髓损伤后周围神经存在退变现象,且退变程度随时间的延长逐渐加重,说明大鼠完全横断性脊髓损伤可以导致损伤水平以下周围神经发生跨神经元变性。

大鼠视交叉上核与室旁核的联系──病毒跨神经元顺行追踪研究

本实验采用假狂犬病毒（猪疱疹病毒）作为跨神经元追踪示踪物，对下丘脑视交叉上核与下丘脑室旁核的联系进行了研究．实验大鼠于摘除双侧颈上交感神经节后，向单侧眼球内注入假狂犬病毒，术后动物分别存活48、56、72及96h．结果显示：56h组仅在视交叉上核内有极少数的细胞被病毒感染；72h组机交叉上核内被病毒标记的细胞增多，定劳核内也出现了被病毒感染的神经元，主要集中在背内侧帽区；96h组在室旁核内被病毒感染的神经元增加，除背内侧帽区外，其它亚孩也出现了被病毒感染的神经元；各实验组的亚室旁带未见有被病毒标记的神经元．以上表明视交叉上核的传出纤维直接投射到室旁核，两核团神经无间可能存在有直接的突触联系．

用单纯疱疹病毒I型跨神经元输送对大鼠小脑纤维联系的研究

实验选用ＳＤ大鼠２３只，分别在小脑前、后叶定位定量（１０～１５μｌ）注射单纯疱疹病毒Ｉ型（ＨＳＶ１，ＨＫ－２株，滴度１０－７）存活１～５ｄ或１０ｄ后灌杀取脑切片，经抗ＨＳＶ１血清行免疫组织化学ＡＢＣ法反应。结果显示，免疫阳性神经元呈类似Ｇｏｌｇｉ样染色，胞体和树突标记清晰。注射部位不同或术后动物存活时间不同，其标记细胞出现的数量和部位也不同。１．后叶注射后１ｄ可出现小脑Ｐｕｒｋｉｎｊｅ细胞及小脑核的标记，术后２ｄ标记细胞可进一步出现在脑桥核、下橄榄核、前庭内侧核等。术后３ｄ则另可在中缝核群、网状结构、室周灰质、丘脑腹外侧核发现标记细胞。２．前叶注射后３ｄ，除有与后叶相似结果外，标记神经元还出现在红核、楔核、楔形核、外侧网状核、巨细胞网状核和Ｃａｊａｌ中介核。实验结果表明：ＨＳＶ１（ＨＫ－２株）注入小脑后可在神经元内进行逆行和顺行输送，其在脑内的跨神经元输送主要是顺行的，输送距离与存活时间有关。在选择正确的存活时间和滴度的情况下，ＨＳＶ１（ＨＫ－２株）是一种良好的用于中枢神经系统的神经束路追踪剂。如在小脑不同部位注射，可显示良好的小脑传出。

碘酸钠诱导兔视网膜和视神经跨神经元变性的研究

目的观察碘酸钠静脉注射能否诱导实验动物的视网膜和视神经出现跨神经元变性。方法48只青紫兰兔,8只为对照组,剩余40只进行碘酸钠静脉注射(40mg/kg),观察注射后1周、2周,1、4、18个月实验动物视网膜和视神经的病理改变,并与对照组进行对比。采用DNA末端转移酶介导的dUTP缺口末端标记法(TUNEL)标记凋亡细胞;变色酸2R染视神经髓鞘;GuilleryShirra-Webster法染变性的神经纤维。结果视网膜内核层的神经元在碘酸钠注射后1周开始凋亡。视网膜神经节细胞(RGCs)在注射后1个月开始凋亡。在注射后的4个月和18个月,可见视神经不同程度的脱髓鞘和变性。结论碘酸钠静脉注射可诱导实验动物视网膜跨神经元变性。

跨神经元追踪

对中枢神经系统内部神经传导通路的形态学研究,经历了漫长的岁月。通过古典的溃变镀银法和Nissl法到70年代初兴起的示踪法,已发现了大量脑内神经元的联系通路。特别是示踪法问世后有些示踪物既可通过轴浆流顺行运输又可被逆行运输,使用它们可以显示出单个神经元的轴突、轴突分枝及与之相连的神经元细胞体。示踪法的出现及近年来的发展,大大地丰富了人们对脑内神经元联系通路的认识。但是,迄今所使用的示踪物,只能在某一级神经元内部被顺行或逆行运输,因而不能显示神经元链,即不能将神经元的连续状态同时显示出来,从而限制了人们对神经通路的更多,更确切的认识。为此。

靶向“肾-肝-脑”轴系统探讨督脉取穴对脑梗死跨神经元变性的影响

急性脑梗死(acute cerebral infarction,ACI)后的跨神经元变性严重阻碍神经功能的恢复,胶质细胞的增生以及由此引起的轴突损伤在跨神经元变性中起了重要作用;"肾-肝-脑"轴系统(肾虚,导致气虚血瘀,痰瘀阻络,久则化热,携肝风内动,上扰脑窍)是中风病急性期的核心病机,督脉通过经络与上述轴系统发生联系,在中风的发病及治疗中占有重要地位,合理地进行督脉取穴对脑梗死跨神经元变性有治疗作用。

大鼠视交叉上核与视上核的纤维联系—病毒跨神经元追踪,免疫组化双重标记法研究

大鼠视交叉上核与视上核的纤维联系—病毒跨神经元追踪，免疫组化双重标记法研究王蕾欧可群陈文玉操高原张军马玉琼（华西医科大学组织学研究室）有文献报道视交叉上核（ＳＣＮ）的传出纤维到达室旁核（ＰＶＮ），但是否有传出纤维投射至视上核（ＳＯＮ），目前尚未见报道...

视交叉上核、弓状核、穹窿下器间神经联系的研究──病毒跨神经元顺行追踪

视交叉上核（SCN）通过直接的纤维联系调控弓状核（ARC）的功能，ARC又通过调控穹窿下器（SFO）而调节心血管系统的功能。由于所采用方法的局限，对上述核团间的直接联系研究欠深入。为了进一步证实ARC与SFO神经元间以及SCN和ARC神经无间有无直接的纤维联系，本实验采用假狂犬病毒（PRV）跨神经元追踪、免疫荧光及免疫组化ABC法，通过病毒在各核团出现的时序来分析其间的联系。成年SD大鼠18只，体重25O－300克，动物行双侧颈上节切除术后，干单侧眼球内注射PRV3μ1，动物分别存活56、72、96小时。结果：①56h组，PRV阳性神经元主要出现在SCN腹外侧份，ABC法显示多数神经元系合VIP；②72h组，SCN内PRV阳性神经元增多，ARC内呈现出PRV阳性神经元，它们系小细胞神经元散在分布于整个核团。③96h组SFO内出现PRV阳性神经元，神经元体积较小，均匀散在分布。各时间组PRV阳性神经元脑体和树突均清晰可见。结果提示，动物存活56hSCN内出现PRV阳性神经元，经复制后，72h到达ARC，再经复制于96h到达SFO神经元。根据PRV阳性神经元出现的时序我们推测SCN与ARC神经元间以及ARC与SFO神经元间可能存在直接的纤维联系。SCN通过神经联系影响ARC的功能，ARC又通过直接的神经纤维联系参与SFO功能的调控。

视交叉上核、隔核、乳头体核间神经联系的观察──病毒跨神经元顺行追踪

隔核、乳头体均属于边缘系统，参与内脏活动、摄食行为、性行为、记忆等的调节。视交叉上校（SCN）有纤维直接投射到外侧隔核，隔核纤维有的又投到乳头体。视交叉上核、隔核、乳头体核间是否存在直接神经的联系，未见详细报道。为了证实上述核团间有元直接的联系。本实验采用假狂犬病毒（PRV）跨神经元追踪、免疫荧光及免疫组化ABC法，以病毒在各核团出现的时序来推论它们之间的联系。成年SD大鼠18只，体重250－300克，动物行双侧颈上节切除术后，于单侧眼球内注射PRV3ul，动物分别存活56、72、96小时。结果：①56h组，PRV阳性神经元主要出现在SCN腹外侧份，ABC法显示多数神经元系含VIP。②72h组，SCN内PRV阳性神经元增多，外侧隔核内呈现出PRV阳性神经元，该神经元散在分布于核团内。③96n组乳头体外侧核出现PRV阳性神经元，它们系大细胞神经元，集聚在小范围的乳头体外侧核内。结果提示，动物存活56hSCN内出现PRV阳性神经元，经复制后72h到达到侧隔核，再经复制于96h到达乳头体外侧核。根据PRV阳性神经元出现的时间顺序，我们推测SCN内主要由腹侧份的神经元投射到外侧隔核，由外侧隔核直接投到乳头体外侧核，上述核团间可能存在直接的纤维联系，即SCN直接参与内脏活动、摄食行为、性行为、记忆等调节?

病毒跨神经元追踪、免疫荧光双标法的应用

为进一步探讨视网膜节细胞的轴突终末与视交叉上核（SCN）内VIP和AVP能神经元间的联系，采用假狂犬病毒（PRV）跨神经元顺行追踪及免疫荧光双标法。对成年大鼠单侧眼球内缓慢注入PRV（Bartha株、5X108PFU／ml）3PI，留针10分钟。动物分别存活56、72和96小时。1％戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，经左心左灌注生理盐水（每100ml含肝素100单位）持续5分钟，流速30—40ml／分钟，冷固定液（含4％多聚甲醛、15％苦味酸，用0IM／L磷酸缓冲液配制、PH7‘4），开始流速为朋～40ml分钟，持续5～7分钟，然后降慢到10ml／分钟，维持半小时。开颅取材、修块、入上述固定液后固定一小时，再转入ZO％蔗糖磷酸缓冲液过夜、恒冷箱切片，片厚30Pm。免疫荧光双标法：含03％Triton、2％驴血清（NDS）的001PBS（pH7．4）稀释混合两种一抗，羊抗PRV1：2000，兔抗VIP或AVP1：2000，室温24～48h。二抗分别为驴抗羊IgG（IRITC标记）1：100，驴抗兔IgG（FITC标记）1：50，用2％NDS的0．01MPBS稀释，室温1．sh。以上各步间均用0．01MPBS漂洗10’X3.裱片，PBS甘油封片。免疫荧光双标操作在暗室里进行。结果；被PRV标记的细胞呈现出，绿色荧光，含VIP或AVP能神经元呈现出红色荧光，既含PRV又含VIP或AVP的神经元即双标细胞呈现出桔黄色荧光?

假狂犬病毒用于跨神经元追踪中的电镜观察

神经传导通路的追踪研究经历了经典的演变法、NISSI法和70年代兴起的HRP示踪法，但它们因均有一些缺陷而不理想。80年代末以来，欧美神经解剖学家们开始把活的亲神经性病毒（主要是单纯病疹病毒和假狂犬病毒）作为跨神经元传递的示踪剂来研究某一特定机能的神经传导通路，取得了可喜的成就。这些研究多集中于病毒跨神经元追踪的应用，有关病毒超微结构水平的研究报道甚少。本文选用SD大鼠6只，单侧眼球内注射假狂犬病毒（PRV，4μl，5×108／pfu／ml），存活72h后灌注固定，取含视交叉上核（SCN）的脑组织，经修块、常规EM包埋，切超薄片、铅铀染色，H—600下观察。结果：（1）SCN受感染的神经元成份中含有中央致密、周围密度低呈圆形的核衣壳，其直径为40～60urn，易于辨认；（2）核衣壳多聚积在核内和神经元突起中，胞浆中量少；（3）胞浆内个别核衣壳被呈新月状的内质网包绕，偶见核衣壳外裹有完整囊膜呈圆球形的发育成熟病毒，其直径为80－100urn。上述结果表明：（1）PRV在细胞核内被复制并装配成核衣壳；（2）PRV的发育成熟与细胞的膜性结构相关；（3）在此存活时间段内，SCN受感染的神经元E处于PRV复制阶段，故神经元内极少见到发育成熟的病毒。

大鼠松果体的中枢神经支配──病毒跨神经元顺行追踪研究

大量研究证明，松果体（Pi）的功能同它的神经支配密切相关，因此，研究Pi的神经支配就十分必要。但长期以来对此存在着异议，一些学者认为Pi的神经支配仅来源于双侧颈上交感神经节（SCG），另一些又提出Pi的神经支配不仅来源于SCG，而且也接受来自脑或其它地方的纤维投射。本研究用假狂犬病毒（PRV）作顺行跨神经元追踪，进一步探讨Pi的神经支配。17只雄性SD大鼠在单侧眼球内注入3一PRV（Bartha株、5X10’PFU／ml）前施行双侧SCG摘除术，术后分别存活56、72和96hr。PRV标记的神经元用免疫组化ABC法显示。结果；（1）56hr组仅在视交叉上核（SCN）内在极少数神经元被PRV标记；（2）72hr组除SCN外，在丘脑下部前区、下丘脑室旁核（PVN）、缰核（Hb）和外侧膝状体（LGH）出现了PRV标记的神经元。与此同时，在松果体的被膜内和松果体细胞之间也呈现出PRV标记的神经纤维；（3）随着动物存活时！和延长，96hr组在上述提及区域内被PRV标记的神经元和神经纤维数量增多。以上结果表明松果体接受了来自视网膜节细胞（RGC）的光信息。结合其他学者的报道，我们推测从视网膜及下丘脑投射到松果体的神经通路可能有以下几条：①RGC～LGH～Pi。＠PGC～Hb～Pi，＠SCN～PVN—Pi，＠SCN～LGH～Pi和⑤SCN～Hb－Pi。

蒿甲醚对大鼠神经元细胞线粒体跨膜电位与细胞膜通透性的影响

[目的 ]通过观察蒿甲醚对原代培养的神经元细胞和传代培养的嗜铬细胞瘤细胞 (PC 12 )的线粒体跨膜电位以及细胞膜通透性的影响 ,探讨蒿甲醚引起神经元细胞毒性的作用方式和毒性机制。 [方法 ]将蒿甲醚分 4个剂量组 ( 0、10 -5、10 -4 、10 -3mol/L)处理原代培养的神经元细胞和嗜铬细胞瘤细胞 (PC 12 ) 6h后 ,用碘化丙啶 (PI)和罗丹明 12 3(Rhodamine 12 3)荧光染料染色 30min ,PBS清洗两次后通过流式细胞仪测定细胞内PI和Rhodamine 12 3荧光染料的荧光强度来分析细胞线粒体跨膜电位和细胞膜通透性的变化。 [结果 ] ( 1)蒿甲醚能增强原代培养的神经元细胞和传代培养的嗜铬细胞瘤细胞 (PC 12 )内的PI荧光强度 ,作用 6h后 ,与正常对照组细胞相比 ,药物组正常细胞数减少或消失 ,细胞内PI的荧光强度随蒿甲醚浓度的升高而增强 ,峰向右移动 ,具有显著的剂量 效应关系 ;( 2 )蒿甲醚可明显降低原代培养的神经元细胞和传代培养的嗜铬细胞瘤细胞 (PC 12 )内的Rhodamine 12 3的荧光强度 ,与正常对照组细胞相比 ,药物组正常细胞数减少 ,细胞内Rhodamine 12 3的摄取量明显减少 ,荧光强度随蒿甲醚浓度的升高而下降 ,峰向左移动 ,具有显著的剂量 效应关系。 [结论 ]蒿甲醚与原代培养的神经元细胞和传代培养的嗜铬细胞?

大鼠胸髓横断后腰髓下运动神经元的变化

目的探讨脊髓损伤后远端下运动神经元结构、功能的改变。方法将70只Sprague-Dawley大鼠随机分为T10脊髓横断3 d组(n=10)、1周组(n=10)、2周组(n=10)、4周组(n=15)、8周组(n=15)和假手术组(n=10),进行L4-6脊髓节段TUNEL荧光标记、ACh E酶组化定量检测。结果 TUNEL标记法观察损伤远端脊髓前角的细胞凋亡情况,结果仅偶见荧光标记物。脊髓横断3 d时,ACh E阳性运动神经元(面积>300μm2)的OD值明显减小(P<0.01);损伤1周时,OD值突然明显增大(P<0.01);随后OD值再次下降,至4周时降至最低点,然后再次增加,8周时与假手术组仍存在显著性差异(P<0.05)。结论脊髓损伤后远端下运动神经元没有明显减少及结构的不可逆改变,但代谢功能发生显著的可逆性变化。

假狂犬病毒示踪大鼠脑瘫状态下腰段和颈段脊髓神经元间联系的研究

目的:应用假狂犬病毒(PRV)示踪腰段和颈段脊髓神经元之间的联系。方法:雄性脑瘫模型SD大鼠30只,左侧坐骨神经注射PRV,4天后灌注取材,之后行PRV免疫组化染色。结果:腰段脊髓左侧灰质前角中可见PRV感染细胞,而颈段脊髓中未见到PRV感染细胞。结论:腰段脊髓和颈段脊髓神经元之间没有直接的神经纤维联系。

大鼠下丘脑室旁核对淋巴结免疫功能的神经调控

目的 探讨下丘脑室旁核 (PVH)是否通过直接的神经联系对淋巴结的功能进行调控。方法 采用假狂犬病毒 (PRV)跨神经元追踪方法研究肠系膜淋巴结注射PRV大鼠PVH内PRV感染神经元的分布 ,同时采用免疫组化方法研究腹腔注射细菌脂多糖 (LPS)后大鼠PVHc fos表达的变化。结果 在注射PRV动物的PVH内出现被PRV标记的阳性神经元 ,既有大细胞神经元 ,也有小细胞神经元 ,它们主要分布在PVH尾侧帽部和内侧部。FOS阳性产物在PVH的神经元核中出现 ,其阳性细胞的分布范围及阳性细胞的数目在LPS注射组均明显大于对照组。两批不同实验动物的相同冠状平面比较 ,可发现PVH中大多数PRV标记的阳性神经元出现在LPS注射后FOS阳性细胞数目增多的区域内。结论 PVH可能通过直接的神经环路与淋巴结相互联系 。