葡萄糖PDS对单层人腹膜间皮跨细胞电阻及迁移修复能力的影响

目的:观察不同浓度葡萄糖PDS(PDS)对单层人腹膜间皮细胞(HPMCs)跨细胞电阻(TER)以及迁移修复能力的影响。方法:用不同葡萄糖浓度PDS(1.5%,2.5%,4.25%)分别与DMEM以1:1比例混合后体外培养HPMCs。四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法测定细胞增殖。使用双池培养皿(transwell)构建HPMCs单层细胞模型。采用TER技术测定PDS对HPMCs通透性的影响。划痕损伤实验观察葡萄糖对HPMCs修复再生能力的影响。结果:不同浓度葡萄糖PDS(1.5%,2.5%,4.25%)干预均可明显地抑制HPMCs的增殖(P<0.05)。TER值随PDS干预时间的延长而逐渐下降,且与葡萄糖浓度呈负相关(P<0.01)。葡萄糖PDS可明显抑制HPMCs迁移修复能力,且与葡萄糖浓度相关。结论:高糖PDS液抑制细胞增殖,降低单层HPMCs的TER值,并抑制HPMCs损伤后迁移修复能力。提示PDS中高糖成分是导致腹透患者腹膜高通透性和超滤衰竭的重要因素。

豚鼠内耳微血管内皮细胞的跨细胞电阻

目的 研究豚鼠内耳微血管内皮细胞跨细胞电阻的动态变化及峰值大小。方法 ①胶原酶消化法分离培养豚鼠内耳及脑微血管内皮细胞 ,免疫组化法进行鉴定 ;②建立起内皮细胞通透性的体外模型 ,研究该模型下内耳内皮细胞的跨细胞电阻 ,并与脑及肺内皮细胞进行比较。结果 ①培养细胞致密融合时具有内皮细胞培养时典型的“铺路石样”外观 ,与肺内皮细胞株的形态一致 ,经免疫组化检测其内皮细胞标志性抗原Ⅷ因子 ,95 %以上的培养细胞的胞浆中呈棕黄色阳性反应 ;②三种内皮细胞在培养增殖过程中其跨细胞电阻值呈动态变化过程 ,以 5× 10 4 cm2 的细胞密度接种时 ,7d左右电阻到达峰值 ,内耳、脑及肺三种内皮细胞的跨细胞电阻峰值大小分别为 (118 9± 18 5 )Ω cm2 ,(2 44 7± 46 9)Ω cm2 ,(4 6 6± 5 9)Ω cm( n =6) ,三者相差非常显著 (P <0 0 0 1)。结论 内耳微血管内皮细胞跨细胞电阻峰值小于脑内皮而大于肺内皮细胞 ,证明了三者通透性的差别。

偶联因子6抑制肌球蛋白轻链磷酸化增加跨内皮细胞电阻

目的探讨偶联因子6(CF6)对人肺微血管内皮细胞(LMVEC)跨内皮细胞电阻(TER)的影响。方法体外培养LMVEC,于不同时间给予不同剂量(高剂量:10^(-6) mol/L,低剂量10^(-6) mol/L)的CF6刺激,通过细胞电阻测定仪(ECIS)及Western blot观察其对TER及相关活化信号分子的影响。结果与对照组比较,CF6刺激组细胞形态无明显改变,但TER值显著增加,随着CF6孵育时间的增加,TER值明显增加,TER(ohm)峰值出现在15h后(1.39±0.02 vs 1.00±0.02,P<0.01),增加观察时间至24h发现TER维持在高水平(1.350±0.018 vs 1.000±0.023,P<0.01)。用10^(-6)和10^(-7)mol/L的CF6孵育,TER虽剂量增加,但是组间差异无统计学意义(1.39±0.02 vs 1.37±0.01)。CF6刺激组明显抑制磷酸化肌球蛋白轻链(p-MLC)水平,但是高、低剂量组间差异无统计学意义(P>0.05)。并且和TER测定结果相似,CF6抗体能够中和CF6刺激引起的p-MLC水平降低。结论 CF6可能通过抑制细胞骨架运动调节蛋白p-MLC水平,增加TER,参与内皮细胞渗透性的调节。

CXCR4/SDF-1轴调节人肺腺癌PC-9细胞对Bends细胞血脑屏障模型功能的影响

目的:通过建立体外血脑屏障(blood brain barrier,BBB)模型,探讨人肺腺癌PC-9细胞在CXCR4/SDF-1轴作用下对BBB紧密连接蛋白的影响。方法:利用永生化的小鼠脑微血管内皮细胞Bends进行单层培养,建立体外BBB模型;通过跨内皮细胞电阻(transendothelial electrical resistance,TEER)测定及荧光素钠通透性实验判定体外BBB模型的功能状态以及观察PC-9细胞对体外BBB模型功能的影响。Western blotting检测PC-9细胞在CXCR4抑制剂AMD3100、SDF-1单独或联合(1μg/ml AMD3100,100 ng/ml SDF-1,AMD3100+SDF-1)作用下对BBB模型功能和内皮细胞紧密连接蛋白表达的影响,Transwell迁移实验检测CXCR4/SDF-1轴对PC-9细胞跨BBB模型细胞层迁移能力的影响。结果:Bends细胞单层培养可形成紧密连接的"屏障"并产生较高的TEER,第96 h达到(182.13±5.19)Ω·cm^2;同时行荧光色钠通透性实验结果显示,BBB具有良好屏障性能,其通透率低于空白对照组(P<0.05)。PC-9细胞作用后,BBB模型TEER逐渐降低,第24 h降至(46.7±4.35)Ω·cm^2;同时BBB通透率较作用前显著提高(P<0.05)。PC-9细胞在AMD3100作用下能够上调内皮细胞紧密连接蛋白的表达(P<0.05);AMD3100处理组的PC-9细胞穿过BBB的细胞数较空白组明显减少[(43±2)vs(81±2)个,P<0.05]。结论:AMD3100能够减弱PC-9细胞对Bends细胞建立的体外BBB模型紧密连接的破坏能力。

丙烯腈对原代双室培养的大鼠睾丸支持细胞的毒性

[目的]研究丙烯腈(ACN)对原代双室培养的大鼠睾丸支持细胞(Sertolicell,Sc)的毒性,以探讨ACN诱导雄性生殖毒性机制。[方法]用已分离纯化的大鼠睾丸SC为材料,用原代双室培养方法,加和不加S9,以浓度为0、0.5、5.0、25.0μg/mlACN染毒,于4、12、24、48h后检测跨细胞上皮电阻(TER);染毒24、48h后检测转铁蛋白(Trf)浓度,评价ACN体外染毒对大鼠睾丸SC的损伤。[结果]ACN浓度≥5.0μg/ml时,对TER的形成有明显抑制作用;5.0μg/ml培养48h、25.0μg/ml培养12h后对已形成的TER引起下降;加S9(+S9)与不加S9(-S9),TER值接近(如25.0μg/ml组培养12h后+S9组为480.3,-S9组为486.3),无明显差异。浓度为25.0μg/ml时,ACN染毒引起外室Trf浓度升高,明显高于对照及其他组(P<0.05),内室Trf浓度变化不明显,因此内室与外室之间Trf浓度差值缩小。[结论]结果表明ACN对双室培养的SCTER的形成有抑制作用,对已形成的TER有降低作用;提示ACN可能对SC形成的紧密连接和“血睾屏障”有影响。

豚鼠耳蜗微血管内皮细胞的跨内皮细胞电阻及对牛血清白蛋白的通透性

目的 :研究豚鼠耳蜗微血管内皮细胞跨细胞电阻的动态变化及峰值大小 ,以及细胞单层对12 5I 牛血清白蛋白的通透性。方法 :①用小池技术建立起该内皮细胞通透性的体外模型 ;②研究该体外模型跨细胞电阻及对12 5I 牛血清白蛋白的通透性。结果 :①耳蜗内皮细胞在培养增殖过程中其跨细胞电阻呈动态变化过程 ,以 5×10 4/cm2 的细胞密度接种时 ,7d左右电阻到达峰值 ,其跨细胞电阻峰值大小为 (118.9± 18.5 )Ω/cm2 ;②体外模型中加入12 5I 牛血清白蛋白后 ,贝克 时间变化图呈抛物线型上升曲线 ,90min内几乎呈直线。结论 :跨细胞电阻及对12 5I 牛血清白蛋白变化曲线反映了体外耳蜗微血管内皮细胞的通透性特征。

探讨脂多糖诱导的中枢神经系统炎症反应对体外血脑屏障功能的影响

目的利用bEND.3小鼠脑微血管内皮细胞及星形胶质细胞建立体外血脑屏障模型,并观察脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的中枢炎症对血脑屏障功能的影响。方法培养小鼠原代脑微血管星形胶质细胞,利用流式细胞术对原代星形胶质细胞标记物胶质纤维酸性蛋白进行细胞纯度鉴定后,将其与bEND.3小鼠脑微血管内皮细胞进行共培养构建体外血脑屏障模型。将小鼠原代星形胶质细胞、bEND.3小鼠脑微血管内皮细胞、共培养的血脑屏障模型均分为对照组和LPS处理组。LPS处理浓度为20μg/ml,处理时间为24 h。通过跨内皮细胞电阻(trans-epithelium electrical resistant,TEER)检测血脑屏障功能,Western blot检测血脑屏障连接蛋白Occludin和ZO-1蛋白含量。结果原代培养的星形胶质细胞呈典型的多突起形态,流式细胞学鉴定细胞纯度为96%。三种细胞分别进行LPS处理后,TEER值均较各自对照组明显下降(P<0.05),Occludin和ZO-1蛋白相对表达量均较各自对照组明显下降(P<0.05)。结论bEND.3小鼠脑微血管内皮细胞和星形胶质细胞共培养可成功建立一种体外血脑屏障模型,LPS诱导的中枢神经系统炎症反应会使血脑屏障完整性受损,破坏其功能。

建立体外血脑脊液屏障模型方法学研究

目的:采用原代分离培养Sprague-Dawley(SD)大鼠脑微血管内皮细胞(brain microvascular endothelial cells,BMECs)和星形胶质细胞(astrocyte,As)建立相对简单可靠、重复性好、接近在体状态的体外血脑脊液屏障(blood-cerebrospinal fluid barrier,blood-CSF barrier)模型。方法:原代分离、纯化和培养BMECs和As,通过细胞形态学和免疫细胞化学染色方法鉴定原代培养的细胞;通过培养在具有特殊质材和孔径的Transwell小室上建立体外血脑脊液屏障实验模型,采用倒置显微镜观察细胞形态结构,经跨内皮电阻值(trans endothelial electricalresistance,TEER)、4h液面试漏实验、两种特征性酶检测、荧光素钠通透性(sodiumfluorescent,NaFLU)评价模型的屏障功能。结果:原代培养的BMECs具有典型的"铺路石"样外观,Ⅷ因子鉴定细胞纯度在95%以上;As有细长突触,胞质较浅,胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic portein,GFAP)鉴定细胞纯度在95%以上。通过测定TEER值共培养模型组显示高电阻值(378.97±11.38)Ω·cm2;4 h液面试漏试验阳性;γ-谷氨酰转肽酶(γ-glutamyltranspeptidase,γ-GT)和碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)表达分别为(30.88±2.87)μmol·min-1·mL-1和(2.51±0.88)金氏单位·100 mL-1;Na-FLU跨膜渗透系数(2.228±0.85)×106 cm·s-1。结论:建立的体外血脑脊液屏障模型在形态学、电阻和通透性方面具备了血脑脊液屏障的基本特性。

IL-1β对肠上皮细胞屏障通透性的影响

目的炎症性肠病是儿童和青少年时期重要的慢性胃肠道疾病，肠黏膜屏障的损伤在其发病中起重要作用。本研究通过IL-1β刺激Caco-2细胞单层，体外模拟炎症性肠上皮细胞屏障，为研究炎症性肠病的发病及治疗提供基础。方法体外培养Caco-2细胞21d模拟肠上皮细胞单层屏障。炎症1组从培养第5天开始每隔1天应用IL-1β处理2h检测TEER值，至第2l天。炎症2组于培养第18天换用含IL-1β培养液，分别于处理0、12、24、48、72h检测TEER。正常对照组用普通培养液培养，也于相应时间点检测TEER。结果正常对照组细胞TEER从第5天至第15天逐渐增加，在第15天达到600Ω·cm^2，并到达平台期保持至第21d。炎症1组细胞TEER值均低于正常组细胞，并且直至第21天仍〈500Ω·cm^2。炎症2组细胞显示时间依赖性的TEER逐渐降低，在48h达到最大值，然后在72h轻度回升。结论培养2～3周的Caco-2细胞能够形成具有极性的肠上皮细胞单层，对其给予IL-1β刺激可在体外模拟炎症性肠上皮细胞屏障。

星形胶质细胞及淋巴细胞在多发性硬化血脑屏障中作用机制研究

目的 本研究旨在探索星形胶质细胞(astrocyte,AS)和淋巴细胞(lymphocytes,LCs)在多发性硬化(multiple sclerosis,MS)血脑屏障(blood brain barrier,BBB)受损中的作用.方法 分离初代大鼠脑微血管内皮细胞(rat brain microvascular endothelial cell,rBMECs)和鼠AS并建立体外BBB模型.通过比较rBMECs单培养和其与AS混合培养组的跨内皮细胞电阻(transendothelial cell resistance,TEER)和渗透性来评估正常BBB的细胞模式.在rBMECs和LCs共培养组和rBMECs、AS、LCs共培养组中通过对神经生长因子(nerve growth factor,NGF)、基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)-2、MMP-9、白细胞介素(interleukin,IL)-17、干扰素(interferon-γ,IFN-γ)、FoxP3的mRNA表达水平的检测进一步研究MS的炎症反应特点.结果rBMECs和AS共培养组比rBMECs单培养组的TEER高(>300Ωcm2),而其LCs渗透率却更低(<200000).与rBMECs单培养组相比,rBMECs、AS、LCs共培养组的NGF、IL-17、IFN-γ的表达降低,而MMP-2和Foxp3表达增高,差异均有统计学意义(P=0.036,0.022).与rBMECs和AS的共培养相比,rBMECs、AS、LCs共培养组MMP-2的表达增加,NGF,IL-17和IFN-γ的表达降低.结论AS和LCs之间相互作用的可能会增加MMP-2的表达,降低IL-17、IFN-γ的表达.提示AS与LCs的协同作用可能参与了MS的发病.

猪脑微血管内皮细胞和星型胶质细胞共培养模拟体外血脑屏障模型

血脑屏障是隔离外周体循环和中枢神经系统的屏障结构。它可以选择性允许血液中的一些物质通过脑微血管内皮细胞进入大脑中。除了脑微血管内皮细胞之外,血脑屏障的组成主要还有星型胶质细胞、周细胞、神经元和细胞外基质。本试验通过原代培养猪脑微血管内皮细胞和星型胶质细胞,以Transwell细胞板为载体构建猪体外血脑屏障的共培养模型。经过4h渗漏试验和TEER电阻的测定试验显示所构建的猪体外血脑屏障的模型具备了血脑屏障基本的生物学特性,可以用于猪血脑屏障相关疾病尤其是人兽共患性疾病致病机制的研究。

星形胶质细胞与淋巴细胞在体外血脑屏障中的相互作用

目的 本实验旨在探讨多发性硬化（MS）发病中血脑屏障（BBB）中星形胶质细胞（AS）与淋巴细胞（LCs）的相互作用.方法 分离原代鼠脑血管内皮细胞（rBMECs）和SD鼠AS并建立体外BBB模型,对rBMECs与AS共培养和rBMECs常规培养进行跨内皮细胞电阻（TEER）和渗透率的比较.用荧光定量法检测rBMECs单独培养、rBMECs与AS共培养、rBMECs和LCs共培养、rBMECs与AS及LCs三重培养四种模式的神经生长因子（NGF）、基质金属蛋白酶（MMP）-2、MMP-9、白细胞介素（IL）-17,干扰素（IFN）-γ,Foxp3的水平.结果 rBMECs和AS共培养比rBMECs单培养的TEER高,而其LCs渗透率却很低;与rBMECs单培养相比,rBMECs、AS和LCs三重培养可降低NGF、IL-17、IFN-γ的表达（P=0.036）,MMP-2和Foxp3的表达增加（P=0.0216）;与rBMECs和AS共培养相比,rBMECs、AS、LCs三重培养能有效降低NGF、IL-17和IFN-γ的表达（P =0.0451）.与rBMECs和AS的共培养相比,rBMECs、AS、LCs三重培养能增加MMP-2的表达（P =0.021）,而MMP-9在四种模式中表达无差异.结论 在体外BBB中原代鼠脑rBMECs和AS共培养比rBMECs单培养的TEER高,AS与LCs共培养可能增加MMP-2的表达,降低IL-17和IFN-γ的表达.

体外血脑屏障模型的建立及功能测定

目的利用大鼠原代微血管内皮细胞及星形胶质细胞建立体外血脑屏障模型,并通过跨内皮细胞电阻(Trans-epithelium electrical resistant,TEER)方法对血脑屏障模型进行功能测定。方法原代分离纯化SD大鼠脑微血管内皮细胞和星形胶质细胞,用免疫荧光检测内皮细胞标志物VWF,紧密连接蛋白ZO-1,星形胶质细胞标志物GFAP;用微血管内皮细胞和星形胶质细胞在Transwell小室上建立体外血脑屏障模型,观察TEER值的动态变化。结果原代的微血管内皮细胞培养至融合后具有典型的梭形"铺路石"样外观,VWF鉴定细胞纯度达到95%以上,ZO-1免疫荧光鉴定证实细胞间形成紧密连接;原代培养的星形胶质细胞呈现具有多个突起的典型形态,GFAP鉴定细胞纯度达到95%以上;在第10 d,单独微血管内皮细胞血脑屏障模型的TEER值为(42±1.41)Ωcm2,内皮细胞和星形胶质细胞共培养血脑屏障模型的TEER值为(65±1.42)Ωcm2。结论建立了体外血脑屏障模型,通过TEER值测定证明共培养使模型更加完整,更加接近在体血脑屏障模型的特性。

苦瓜全粉和苦瓜乙醇提取物健康功效的体外评估

本研究的目的是运用体外模型评估苦瓜全粉和苦瓜乙醇提取物的健康功效。苦瓜全粉和苦瓜乙醇提取物以7.5 mg/mL和15 mg/mL的剂量与新鲜粪便样品进行体外厌氧培养。通过454焦磷酸测序技术分析粪便菌群组成的变化,同时测定发酵上清中短链脂肪酸的含量以及对Caco-2单层细胞跨膜电阻的影响。结果显示,苦瓜全粉(15 mg/mL)可以明显地扶植Faecalibacterium属细菌,同时抑制Bilophila和Desulfovibrio属细菌的增殖;同等剂量的苦瓜全粉发酵上清中短链脂肪酸的含量明显高于苦瓜乙醇提取物发酵上清;源自苦瓜乙醇提取物(15 mg/mL)的发酵上清对Caco-2单层细胞跨膜电阻的增强作用要大于苦瓜全粉(15 mg/mL)。本研究探究了体外苦瓜全粉和苦瓜乙醇提取物不同的生理功效,为以后苦瓜制品的选择提供了初步证据。