鼠抗重组人跨膜四蛋白33抗体的制备及其研究

目的制备鼠抗重组跨膜四蛋白33（TSPAN33）抗体并验证TSPAN33在桥本氏甲状腺炎外周血B细胞中的表达。方法通过PCR法从霍奇金淋巴瘤细胞的cDNA中扩增TSPAN33基因，并构建到pET32a表达载体中。使用IPTG诱导重组蛋白的表达，通过镍柱亲和层析纯化获得TSPAN33蛋白。以纯化的TSPAN33蛋白混合福氏完全佐剂免疫Balb／e小鼠制备抗体，通过合成TSPAN33胞外区肽段耦联环氧基磁珠，亲和富集抗TSPAN33胞外区特异性IgG，洗脱得抗体用酶联免疫吸附实验（ELISA）和Westernblot分别检测效价和特异性。同时使用制备的抗体初步对桥本氏甲状腺炎（HT）患者外周血TSPAN33＋B细胞比例进行检测。结果成功的表达、纯化了TSPAN33重组蛋白，抗TSPAN33蛋白免疫后血清通过固相肽段亲和富集纯化后抗体效价为1：64000，Westernblot和流式细胞术分析显示该纯化抗体不但能够与TSPAN33蛋白特异性的结合，同时还能够和天然的TSPAN33结合，流式细胞术结果显示HT患者外周血TSPAN33＋B细胞比例为（4．71±0．43）％，高于健康组（1．95±0．36）％（P〈0．01）。结论以重组TSPAN33为免疫原，成功地制备高效价、高特异性的兔抗TSPAN33抗体，为进一步进行TSPAN33的检测及其临床应用研究奠定了基础。

四次跨膜超家族蛋白3在肿瘤中的研究进展

四次跨膜超家族蛋白3(TM4SF3),又称为CO-029、TSPAN8,在大鼠中被称为D6.1A,是四次跨膜超家族(TM4SF)中的一员。TM4SF3在结直肠癌、肝癌、食管癌及胰腺癌等多种消化系统肿瘤中存在高表达,其表达与消化系统肿瘤患者的不良预后密切相关。TM4SF3可能通过促血管再生、增强肿瘤细胞迁移等促进肿瘤的转移与进展。该文旨在对TM4SF3在肿瘤中的作用及其分子生物学机制等方面的研究进展予以综述。

口腔鳞状细胞癌组织中TM4SF1 mRNA的筛选及其蛋白的表达变化观察

目的筛选口腔鳞状细胞癌(鳞癌)组织中跨膜四超家族成员1蛋白(TM4SF1)mRNA,观察TM4SF1在口腔鳞癌组织中的表达变化,并探讨其临床意义。方法从GEO公共数据库(https://www.Ncbi.nlm.nih.gov/gds)下载口腔鳞癌基因表达谱及相关临床数据(研究号分别为GSE13601、GSE19089、GSE74530、GSE78060、GSE9844)。从这5个TM4SF1探针中获得标准化均差(SMD)和中间表达值。利用GEO数据库的GEO2R工具对口腔鳞癌和癌旁黏膜组织中TM4SF1 mRNA进行筛选和分析。采用免疫组织化学SP法检测口腔鳞癌组织及其癌旁黏膜组织中TM4SF1蛋白,并探讨TM4SF1蛋白与患者临床病理资料之间的关系。结果筛选出口腔鳞癌组织中存在TM4SF1 mRNA,且其表达水平高于癌旁黏膜组织(P<0.05)。M4SF1蛋白主要定位于口腔鳞癌细胞膜中,其在口腔鳞癌组织中阳性表达量高于癌旁黏膜组织(P<0.05)。TM4SF1蛋白在Ⅲ~Ⅳ期口腔鳞癌患者中的阳性表达量高于Ⅰ~Ⅱ期患者(P<0.05),但与其他临床病理资料如民族、年龄、性别、吸烟、饮酒、血型、分级、肿瘤大小、淋巴结转移无关。结论口腔鳞癌组织中筛选出的TM4SF1 mRNA表达升高;TM4SF1蛋白在口腔鳞癌组织中呈高表达,与口腔鳞癌临床分期有关,可能参与口腔鳞癌的发生、发展。

TM4SF1与脑胶质瘤病理分级及预后的相关性

目的探讨跨膜四蛋白超家族成员1(TM4SF1)与脑胶质瘤病理分级及预后的相关性。方法应用生信分析方法,计算机检索TCGA数据库,采用GEPIA分析TM4SF1表达胶质瘤病理分级及生存预后的关系。收集2014年3月至2017年4月手术切除的脑胶质瘤83例[低级别胶质瘤(LGG)35例和高级别胶质瘤(HGG)48例]和23例颅脑损伤内减压术切除的非肿瘤脑组织为对照,采用免疫组化染色法检测组织TM4SF1表达情况,术后随访4年,记录无进展生存期(PFS)和总生存期(OS)。结果生信分析显示:胶质瘤组织TM4SF1 mRNA表达量明显高于正常脑组织(P<0.05);而且,HGG组织TM4SF1 mRNA表达量明显高于LGG组织(P<0.05)。TM4SF1高表达HGG病人OS较低表达病人明显缩短(P<0.05);TM4SF1高表达LGG病人PFS、OS较低表达病人均明显缩短(P<0.05)。临床病例分析显示:胶质瘤TM4SF1高表达率[50.60%(42/83)]明显高于非肿瘤脑组织[13.04%(3/23);P<0.01];HGG组织TM4SF1高表达率[60.42%(29/48)]明显高于LGG组织[37.14%(13/35);P<0.05];多因素Cox比例回归风险模型分析显示,TM4SF1高表达是胶质瘤病人生存预后不良的独立危险因素(P<0.05);生存曲线分析显示,TM4SF1高表达病人中位PFS和OS较低表达病人明显缩短(P<0.05)。结论脑胶质瘤TM4SF1呈高表达,与肿瘤病理分级、不良生存预后有关。

乳腺癌癌组织中LAPTM4B、dCTP焦磷酸酶的表达水平及临床意义

目的研究乳腺癌癌组织中溶酶体四次跨膜蛋白质B(LAPTM4B)、dCTP焦磷酸酶(DCTPP1)的表达水平及临床意义。方法选取2014年3月至2016年6月本院收治的乳腺癌患者93例作为研究对象,收集患者手术切除的肿瘤组织以及癌旁正常组织,采用免疫组化法(SP)检测两组组织中LAPTM4B、DCTPP1的表达情况,分析其临床意义。结果乳腺癌癌组织部位LAPTM4B、DCTPP1阳性表达率明显高于癌旁组织,差异具有统计学意义(P<0.05);TNM分期为Ⅱ期的乳腺癌患者LAPTM4B、DCTPP1阳性率显著高于TNMⅠ期(LAPTM4B、DCTPP1阳性率和Ⅱ期患者(LAPTM4B、DCTPP1阳性率、淋巴结转移的乳腺癌患者LAPTM4B、DCTPP1阳性表达率低于无淋巴结转移患者(LAPTM4B、DCTPP1阳性率,差异均具有统计学意义(P<0.05);随访时间36个月,LAPTM4B、DCTPP1表达阳性患者3年生存率和生存时间均低于阴性患者的生存率和生存时间,差异具有统计学意义(P<0.05);LAPTM4B和DCTPP1同时表达阳性患者3年生存率显著低于两者均阴性患者以及仅LAPTM4B表达阴性或者仅DCTPP1表达阴性患者生存率和生存时间,差异均具有统计学意义(P<0.05)。结论乳腺癌患者LAPTM4B和DCTPP1水平呈高表达状态,且其表达阳性率与患者的TNM分期、淋巴结转移以及预后均存在密切联系,有望成为乳腺癌诊断和预后的评估指标。

跨膜4超家族成员1在肾细胞癌中的表达及临床意义

目的探讨跨膜4超家族成员1(TM4SF1)在肾细胞癌(RCC)中的表达及意义。方法应用实时荧光定量PCR和Western blot方法分析TM4SF1在肾癌A498细胞、os-rc-2细胞株中表达的改变,并与HK2人肾小管上皮细胞相比较,探讨TM4SF1在RCC发生发展中可能的作用。结果实时荧光定量PCR结果显示,与对照组相比较,TM4SF1基因在A498(t=20.24,P<0.01)和os-rc-2(t=23.93,P<0.01)肾癌细胞中mRNA表达水平均明显下降,差异具有统计学意义。Western blot方法检测显示,TM4SF1蛋白表达水平在A498(t=11.78,P<0.01)和os-rc-2(t=12.97,P<0.01)肾癌细胞中均显著低于对照组,差异亦具有统计学意义。结论TM4SF1在RCC中表达水平明显降低,说明其可能参与RCC发生发展的过程。

人TSPAN12蛋白大胞外片段的可溶表达和纯化

目的:构建人源四次跨膜超家族蛋白12大胞外片段(TSPAN12-LEL)的原核表达质粒,诱导表达和纯化后获得可溶的重组蛋白。方法:实验研究。首先将目的基因克隆至pMal-c2x载体上,再经PCR扩增、酶切、连接,将带麦芽糖结合蛋白(MBP)标签的融合蛋白编码序列克隆至pETDuet-1载体的第一个多克隆位点,同时将大肠杆菌的DsbC基因克隆至pETDuet-1载体的第2个多克隆位点,与重组蛋白共表达,促进二硫键的正确形成。将重组质粒转化至OrigamiB(DE3)菌株中,用异丙基-β-D硫代半乳糖苷诱导表达,经交联直链淀粉树脂亲和层析和阴离子交换层析纯化重组蛋白。结果:成功构建重组表达质粒pETDuet-1-MBP-TSPAN12 LEL-DsbC,诱导表达后在蛋白上清中得到大量带MBP标签的融合蛋白(MBP-TSPAN12 LEL),经SDS-PAGE检测该融合蛋白分子量约为60 kD,与理论大小相符,经亲和层析和阴离子交换层析后能获得大量、高纯度可溶的重组蛋白。结论:经过优化,与DsbC蛋白共表达时,带MBP标签的TSPAN12蛋白大胞外片段可以实现在大肠杆菌中可溶表达。

缺氧诱导因子1α、CD151在肝内胆管细胞癌中联合表达及与肿瘤血管生成的关系

目的探讨缺氧诱导因子1α(HIF-1α)、跨膜四蛋白CD151在肝内胆管细胞癌中联合表达及与肿瘤血管生成的关系。方法采用免疫组织化学SP法,检测HIF-1α和CD151在56例肝内胆管细胞癌组织中的表达,并用CD34标记微血管密度(MVD)。结合肝内胆管细胞癌临床病理和MVD资料加以分析。结果在56例肝内胆管细胞癌组织中HIF-1α和CD151的阳性表达率分别为80.4%和66.1%,显著性高于癌旁组织(P<0.05);HIF-1α和CD151蛋白表达呈正相关(r=0.752,P=0.013),HIF-1α阳性表达组MVD(60.3±9.7)高于HIF-1α阴性表达组MVD(52.7±9.4),CD151阳性表达组MVD(59.7±8.3)高于CD151阴性表达组MVD(51.3±8.6),差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 HIF-1α和CD151的表达与肝内胆管细胞癌血管新生有关,促进肝内胆管细胞癌侵袭转移发生。

Tetraspanins与消化道肿瘤的关系

Tetraspanins跨膜蛋白所属的Tetraspanins家族，又称作跨膜四超蛋白家族TM4SF（TM4SF跨膜四超蛋白家族），其通过富含tetraspanins蛋白和其他相关蛋白的形成微模体结构TEMs（tetraspanin—enriched microdomain），影响细胞的有丝分裂和减数分裂，并且通过与肿瘤细胞及其微环境相互作用，促进或者抑制肿瘤的进展。其在不同的肿瘤尤其是进展期肿瘤中的表达有显著的差异，这为肿瘤的诊断、分级和预后提供新指标，同时也为临床基因靶点治疗提供新思路。

沉默Tspan8对人结肠癌HT-29细胞移植瘤和转移灶中的Rap1、Rap1 GAP的影响

[目的]观察沉默四次跨膜超家族蛋白3(Tspan8)对人结肠癌HT-29细胞移植瘤和转移灶中Rap1和Rap1GAP蛋白的影响。[方法]通过生物信息学方法,结合R2平台中的1个基因芯片数据集,以Dukes分期筛选出自身表达与Tspan8表达显著相关的基因,利用KEGG工具对Tspan8相关的基因进行KEGG通路分析。利用慢病毒沉默技术沉默Tspan8在人结肠癌细胞株HT-29中的表达,RT-PCR及免疫组化技术检测HT-29细胞干扰后Tspan8沉默效果,构建结肠癌HT-29细胞转移动物模型。慢病毒沉默HT-29细胞中的Tspan8基因(shRNA+Tspan8+HT-29细胞)为实验组、空载体组为对照组,观察2组移植瘤生长情况。Western blot技术检测裸鼠肝脏转移灶中Rap1、Rap1 GAP的表达情况。[结果]与Tspan8相关的KEGG通路中,Rap1通路在DukeC期及DukeD期中与Tspan8表达存在相关性(P<0.05)。RT-PCR结果表明Tspan8mRNA表达水平在实验组中较对照组明显下调(P<0.05)。沉默Tspan8后,裸鼠肝转移瘤的数目减少、体积和重量变小,免疫组化结果提示实验组肝脏转移瘤组织Tspan8表达均较对照组小鼠明显减少(P<0.05),Western Blot示Rap1、Rap1GAP在实验组肝脏肿瘤组织表达较对照组改变具有统计学意义(P<0.05)。[结论]沉默Tspan8通过Rap1GAP影响Rap1蛋白活性抑制HT-29细胞肝脏转移。