跨膜蛋白88对缺血-再灌注小鼠心肌纤维化的影响及机制研究

目的探讨跨膜蛋白(transmembrane protein 88,TMEM88)对缺血-再灌注小鼠心肌纤维化(myocardial fibrosis,MF)的影响及可能机制研究。方法将36只SPF级C57小鼠随机分为对照组(Control组)、心肌缺血-再灌注模型组(Ischemia reperfusion,I/R组)和心肌缺血-再灌注模型+TMEM88组(I/R+TMEM88组)。采用对左冠状动脉前降支结扎的方法构建缺血-再灌注小鼠模型。利用超声心动图检测各组小鼠心功能;Masson染色检测各组小鼠心脏病理学变化并测定胶原容积分数(Collagen volume fraction,CVF);蛋白免疫印迹(Western blot)法检测β-连环蛋白(β-catenin)、α-平滑肌肌动蛋白(alpha-smooth muscle actin,α-SMA)和E-钙黏蛋白(E-cadherin)的表达情况。结果与Control组比较,I/R组小鼠LVEDD和LVEDV明显增高[LVEDD(mm):3.37±0.25 vs. 4.28±0.56,LVEDV(mm):46.89±8.20 vs. 83.80±22.48],LVFS和LVEF明显降低[(LVFS:(%) 30.33±3.18 vs. 20.71±2.82,LVEF(%):58.77±4.55vs. 42.44±4.80],CVF升高(%:4.06±0.74 vs. 29.54±1.32),β-catenin及α-SMA表达明显增加(β-catenin:0.35±0.17 vs. 0.74±0.14,α-SMA:0.39±0.21 vs. 0.85±0.30),Ecadherin表达减少(0.54±0.16 vs. 0.28±0.10),差异均有统计学意义(P<0.05);与I/R组比较,I/R+TMEM88组小鼠LVEDD和LVEDV减低[LVEDD(mm):4.28±0.56 vs. 3.85±0.29,LVEDV(mm):83.80±22.48 vs. 64.27±11.59],LVFS和LVEF增高[LVFS(%):20.71±2.82vs. 24.14±3.79,LVEF(%):42.44±4.80 vs. 48.53±6.14),CVF降低(%:29.54±1.32 vs.25.06±3.62),β-catenin及α-SMA表达减少(β-catenin:0.74±0.14 vs. 0.58±0.10,α-SMA:0.85±0.30 vs. 0.59±0.11),E-cadherin表达增加(0.28±0.10 vs. 0.41±0.05),差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 TMEM88能够通过抑制Wnt/β-catenin信号通路活性改善缺血-再灌注小鼠的心肌纤维化程度。

跨膜蛋白66生物信息学分析及其突变体转基因小鼠构建

跨膜蛋白66(TMEM66)是与细胞凋亡以及癌症发生密切相关的重要功能基因,为了在个体水平研究其生物学功能,我们进行了TMEM66基因突变体(TMEM66V)转基因小鼠的构建。本研究通过原核注射法进行转基因操作,将获得的312个受精卵移植到13只代孕母鼠中,运用PCR、Southern blotting对出生的小鼠进行转基因鉴定,对于转基因阳性小鼠通过传代试验研究外源基因是否稳定整合,并通过反向PCR方法研究外源基因的整合方式。结果显示在出生的55只小鼠中有6只为转基因阳性,其中3只转基因小鼠可以稳定传代,表明这些小鼠中外源基因发生了稳定整合。反向PCR检测结果发现外源片段是以串联重复的方式整合到转基因小鼠的基因组中。本研究成功构建了TMEM66基因突变体转基因小鼠,为进一步研究TMEM66基因的功能奠定了基础。

慢性乙型肝炎患者肝组织干扰素刺激基因(STING/TMEM173)蛋白表达及其与肝脏炎症等级的相关性

目的研究慢性乙型肝炎(CHB)患者肝组织干扰素刺激基因/跨膜蛋白173(STING/TMEM173)的表达及分布与肝脏炎症等级相关性,并在体外细胞初步探讨可能存在的机制。方法采用免疫组织化学染色法检测62例未经过抗病毒治疗的CHB患者肝组织STING/TMEM173蛋白表达,显微镜下观察STING/TMEM173蛋白在肝组织表达情况,同时采用秩和检验和Spearman相关系数分析STING/TMEM173表达与肝脏炎症等级及血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)水平的相关性。Western blot法分析细胞内瞬时和稳定转染HBV全基因组质粒前后HepG2细胞中STING/TMEM173蛋白的变化;以含有完整的HBV病毒颗粒的HepG2.2.15细胞上清液刺激健康人群外周血单个核细胞,实时荧光定量PCR技术检测STING/TMEM173基因表达。结果STING/TMEM173蛋白在CHB患者肝组织高表达,且主要表达于肝组织炎症细胞,而肝细胞却未见表达。患者肝组织STING/TMEM173蛋白表达与肝脏炎症等级呈显著正相关,且在ALT升高的患者的肝组织STING/TMEM173表达升高。瞬时和稳定转染HBV全基因组质粒后,HepG2细胞中STING/TMEM173蛋白显著下降。此外,含有完整的HBV病毒颗粒的HepG2.2.15细胞上清液呈剂量依赖性促进外周血单个核细胞表达STING/TMEM173。结论HBV可上调肝组织炎症细胞STING/TMEM173蛋白的表达,而表达STING/TMEM173蛋白的肝脏炎症细胞数量可反应肝脏炎症的严重程度。

基于TCGA等数据库分析TMEM88在肝细胞中的表达水平及其与预后的关系

目的比较跨膜蛋白88(transmembrane protein 88,TMEM88)在正常肝细胞和肝癌肝细胞中的表达情况,并观察其与患者预后的关系。方法研究基于公共数据库癌症基因组图谱(TCGA)、STRING、cBioPortal和基因表达总览(GEO)等提供的数据,采用Kaplan-Meier、UALCAN、肿瘤免疫估计资源(TIMER)和基因表达谱富集分析(GEPIA)进行分析。结果TMEM88在肝癌组织中的表达高于相应的正常肝组织。TMEM88在肝细胞癌组织中的表达与预后相关。TMEM88的低表达与肝癌患者的总体生存率、疾病特异性生存率、无进展生存率和无复发生存率有关,特别是在疾病晚期(2级和3级)。TMEM88在肝癌细胞中的MCPCOUNTER浸润率、Xcell浸润率和TEDER浸润率呈正相关。结论TMEM88在肝癌中是一个保护性基因,并促进免疫逃逸,或可作为肝癌的分子标志物,进而指导临床、判断预后。

TMEM16A氯通道对心肌缺血再灌注后损伤大鼠乳酸脱氢酶和肌酸激酶同工酶的影响

目的探讨跨膜蛋白(TMEM) 16A氯通道对心肌缺血再灌注后损伤大鼠乳酸脱氢酶(LDH)和肌酸激酶同工酶(CK-MB)的影响。方法选择SD大鼠分离与培养心肌细胞,分为A组(于常氧条件下培养心肌细胞3 h)、B组(心肌细胞未经任何处理,采用缺氧2 h、复氧1 h进行心肌缺血再灌注处理)、C组(采用TMEM16A氯通道激活剂1 mmol/L预处理20 min,再进行处理)、D组(采用TMEM16A氯通道抑制剂1 mmol/L预处理20 min,再进行处理),观察心肌细胞形态与存活情况,测定LDH和CK-MB、活性氧(ROS)表达水平,采用Western印迹方法测定活化型半胱天冬酶(cleaved caspase)-3、磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)、蛋白激酶B(Akt)表达水平。结果实验前各组细胞存活率均在95%以上,实验结束后A组、B组、C组、D组细胞存活率分别为(93. 44±4. 39)%、(51. 49±5. 22)%、(34. 29±5. 32)%和(78. 29±7. 21)%,各组间对比差异有统计学意义(P<0. 05)。B组、C组、D组CK-MB与LDH活性均明显高于A组(P<0. 05),D组CK-MB与LDH活性明显低于B组、C组(P<0. 05)。B、C组ROS水平明显高于A组(P<0. 05),D组ROS水平与B、C组相比明显减少(P<0. 05),但与A组相比差异依然有统计学意义(P<0. 05)。B、C组cleaved caspase-3、p-Akt相对表达水平明显高于A组(P<0. 05)。结论 TMEM16A氯通道关闭能降低心肌缺血再灌注后损伤大鼠LDH和CK-MB活性,降低ROS水平,抑制cleaved caspase-3/p-AKT信号通路激活,对心肌缺血再灌注后有良好的保护作用。

X线辐射后肺腺癌A549细胞上清外泌体跨膜蛋白88表达与细胞增殖的相关性

目的探讨X线辐射对肺腺癌A549细胞增殖的影响,并观察其上清外泌体跨膜蛋白(transmembrane protein88,TMEM88)的表达情况。方法取对数生长期的肺腺癌A549细胞,分别用0、0.5、1、1.5、2 Gy(剂量率1.75 Gy/time,300 Mu/min)照射细胞,培养6和12 h后,CCK-8法检测不同辐射剂量对细胞增殖的影响;收集细胞上清,超速离心法提取外泌体蛋白,Western blot法分析外泌体TMEM88蛋白的表达情况。结果辐照后培养6 h,2 Gy组A450值明显小于0 Gy组及0.5 Gy组(P<0.05);其他各剂量组与0 Gy组比较,A450值呈下降趋势,但差异无统计学意义(P>0.05);辐照后培养12 h,与0 Gy组比较,各剂量A450值均降低,且呈剂量依赖性,除0.5 Gy组外,其他各剂量组差异均有统计学意义(P<0.05)。辐射后培养6 h,随辐射剂量增加,TMEM88蛋白相对表达水平呈下降趋势,2 Gy组与0 Gy组比较,差异有统计学意义(P<0.05);辐射后培养12 h,随辐射剂量增加,TMEM88蛋白相对表达水平呈逐渐下降趋势,且呈剂量依赖性,各组间差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 X线辐射可抑制肺腺癌A549细胞的增殖及细胞上清外泌体TMEM88蛋白的表达。

RNA干扰TMEM33的表达对宫颈癌细胞生长的影响

目的通过生物信息学方法探究跨膜蛋白33(transmembrane protein 33,TMEM33)在宫颈癌组织中的表达及其与预后的关系,观察TMEM33经RNA干扰后对宫颈癌细胞生长的影响。方法应用基因表达谱数据动态分析(Gene Expression Profiling Interactive Analysis,GEPIA)数据库筛选出与宫颈癌相关的TMEM33基因,设计两条特异siRNA序列进行RNA干扰实验。实验分为3组:siTMEM33#1干扰组、siTMEM33#2干扰组、阴性对照组(非特异性siRNA)。采用Western blot法检测siRNA干扰后宫颈癌SiHa/HeLa细胞中TMEM33蛋白的表达,CCK-8法检测SiHa/HeLa细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡和细胞周期的变化,Western blot法检测细胞凋亡关键基因BCL-2、Bax及细胞周期蛋白CyclinD1、P21的表达变化。结果与阴性对照组相比,特异性siRNA显著下调宫颈癌SiHa/HeLa细胞中TMEM33蛋白的表达(P<0.05);宫颈癌细胞增殖明显受抑,细胞凋亡显著增加,细胞周期S时相明显减少(P<0.05);细胞凋亡关键基因BCL-2表达下降而Bax表达上升,细胞周期蛋白CyclinD1水平降低而P21水平升高(均为P<0.05)。结论TMEM33经RNA干扰后,能明显抑制宫颈癌的细胞生长。TMEM33可能通过影响宫颈癌细胞周期、调节细胞凋亡及细胞周期相关蛋白的表达来促进宫颈癌细胞的生长。

TMEM16A：一种钙离子激活的氯离子通道

钙激活氯通道(calcium-activated chloride channels,CaCCs)是一类在多种细胞中广泛表达的氯离子通道,介导一系列重要的生理功能。TMEM16A(transmembrane protein 16A)于2008年被确认为CaCCs的分子身份之一。TMEM16A在多种病理生理过程中发挥重要的作用,如卵母细胞多重受精、分泌上皮细胞的液体分泌、平滑肌收缩、神经元兴奋、膜电位调节、感官信号传导以及肿瘤的发生和细胞迁移。近年来,TMEM16A在病理生理学中的作用及其在疾病治疗中的药靶地位受到高度重视。本文对TMEM16A研究的最新进展进行综述。

鸡Tmem9B同源基因的克隆与序列分析

溶酶体跨膜蛋白9B(TMEM9B,c11orf15)是最近被发现的炎症信号通路中的关键因子,在NF-κB和MAPK信号途径起重要调控作用.本实验采用克隆技术成功获得了海兰褐鸡Tmem9B基因的全长编码序列,并利用生物信息学方法对Tmem9B进行序列分析和测序.结果表明,鸡Tmem9B同源基因编码序列全长570bp,进化高度保守,编码189个氨基酸的蛋白,序列上存在信号肽、Tmemb_9和跨膜序列等几种结构域,并含N端豆蔻酰化位点、N端糖基化位点、蛋白激酶C磷酸化位点、酪蛋白激酶II磷酸化位点等3种修饰位点.同时,在鸡Tmem9B基因的开放阅读框内预测到5个microRNA靶位点,Tmem9B在鸡的骨骼肌、肾、脑等多种组织中广泛表达,推测鸡Tmem9B基因可能具有多种功能.本研究将为深入研究鸡Tmem9B基因的功能奠定基础.

豚鼠耳蜗血管纹TMEM16A随鼠增龄的表达变化

目的探讨跨膜蛋白16A(transmembrane protein 16A,TMEM16A)在不同鼠龄豚鼠耳蜗血管纹上的表达及其与年龄相关性听力下降之间的关系。方法将健康豚鼠按照年龄分为:2周组、3月组、1年组、D-半乳糖(D-galactose,D-gal)衰老模型组;听性脑干反应(auditory brainstem response,ABR)检测不同鼠龄豚鼠的听力变化;免疫荧光技术和免疫印迹实验(Western blot)检测TMEM16A在不同鼠龄豚鼠耳蜗血管纹中的分布和表达改变。结果 ABR反应阈值随鼠龄增长呈逐渐增高趋势,D-gal组与其他3组之间的差异具有统计学意义(P<0.01)。TMEM16A在不同鼠龄豚鼠耳蜗血管纹中均有表达,且表达量从2周组到1年组随鼠龄的增加呈上升趋势(P均<0.05);D-gal组表达量减少,与3月组和1年组均有统计学意义(P<0.05)。结论 TMEM16A在豚鼠耳蜗血管纹表达的变化可能与年龄相关性听力下降相关。

胶质瘤组织TMEM168的表达与病人预后的关系

目的 探讨跨膜蛋白(TMEM)168在胶质瘤组织中的表达及其与病人预后的关系。方法 选取2014年6月至2016年9月手术切除的符合标准的脑胶质瘤140例和颅脑损伤内减压术中切取的非肿瘤脑组织50例为对照,免疫组化染色检测TMEM168的表达。胶质瘤病人随访截止2021年10月,记录总生存期(OS)及无进展生存期(PFS)。结果 胶质瘤组织TMEM168高表达率[70.71%(99/140)]明显高于对照组[22.00%(11/50);P<0.05]。高级别胶质瘤组织TMEM168高表达率[81.58%(62/76)]明显高于低级别胶质瘤组织[57.81%(37/64);P<0.05]。140例胶质瘤术后随访3~60个月,死亡46例,复发87例。多因素Cox回归分析显示,TMEM168高表达是胶质瘤病人OS和PFS不良的独立危险因素(P<0.05)。生存曲线分析显示,TMEM168高表达胶质瘤病人中位OS、PFS较低表达病人明显缩短(P<0.05)。结论 胶质瘤组织TMEM168呈高表达,与胶质瘤病人不良生存预后有关。

温阳益气方通过上调TMEM16A和c-kit表达改善小鼠慢传输型便秘的机制

目的探讨温阳益气方对慢传输型便秘(STC)模型小鼠跨膜蛋白(TMEM)16A及干细胞因子受体(c-kit)表达的影响。方法采用随机数字表法将小鼠分为正常组和造模组。使用洛哌丁胺灌胃法复制小鼠便秘模型,造模成功后,随机分为模型组,温阳益气方低、中、高剂量组,普芦卡必利组。给药组给予相应的药物干预治疗1 w后,观察小鼠一般情况,检测肠道推进率、粪便含水量,评估组织学活动指数(HAI),检测小鼠结肠肌电及TMEM16A、c-kit mRNA和蛋白表达。结果与正常组比较,模型组出现大便干结伴明显减少,粪便含水量显著下降,肠道推进率降低,肠道黏膜腺体萎缩明显,结肠平滑肌电活动频率及振幅显著降低,结肠频率变异系数积及振幅变异系数显著增高,TMEM16A、c-kit mRNA及蛋白表达均显著下降(P<0.01)。与模型组相比,温阳益气方各剂量组均可增加粪便含水量、提高小鼠肠道推进率、降低HAI,提高结肠平滑肌电活动频率及振幅,降低结肠频率变异系数积及振幅变异系数,提高小鼠结肠组织内TMEM16A、c-kit mRNA及蛋白表达,差异显著,且呈剂量依赖性(P<0.05,P<0.01)。结论TMEM16A与c-kit表达有一定相关性,而温阳益气方改善STC的作用机制可能与提高结肠组织内TMEM16A/c-kit表达,从而调控Cajal间质细胞(ICC)有关。

TMEM97蛋白对神经母细胞瘤侵袭迁移的影响及机制研究

目的探究跨膜蛋白(TMEM97蛋白)对神经母细胞瘤(neuroblastoma,NB)转移的影响及潜在作用机制。方法从GEO和TARGET数据库中下载NB的基因测序数据,分析TMEM97与预后的关联性。免疫组织化学检测患儿NB组织和对照组织中TMEM97的蛋白表达。共表达基因富集分析预测TMEM97生物学作用,并在NB细胞株SH-SY5Y中干扰或过表达TMEM97,Transwell和细胞划痕实验检测细胞迁移和侵袭的变化,Western blot检测转移相关蛋白表达水平。分析预测TMEM97与MYCN扩增的关联性并结合荧光素酶实验检测N-myc对TMEM97转录的影响。结果TMEM97 mRNA在高危型NB中的表达量显著高于低危型,并与NB患儿总生存率、无病生存率呈负相关。TMEM97蛋白表达水平在NB组织中显著高于对照组织。TMEM97主要与细胞黏附相关,可显著促进NB细胞的侵袭和迁移能力,伴随有LMO1、GPC2、Syntenin-1和MMP9转移相关蛋白的显著上调。在MYCN扩增组织中TMEM97 mRNA表达显著高于无扩增组织,并且N-myc可以直接靶向结合启动子促进TMEM97转录,干扰TMEM97的表达可显著抑制N-myc对侵袭和迁移的促进作用。结论TMEM97是一个不良预后因素,受转录因子N-myc直接激活转录并介导NB细胞侵袭和迁移的发生。