跨膜突变型TNF-α的基因构建及体外表达

目的：跨膜型ＴＮＦα（ＴＭＴＮＦα）易在某些蛋白酶的作用下转换为分泌型ＴＮＦα（ＳＴＮＦα）。拟用基因突变技术获得稳定表达的、不能转换成ＳＴＮＦ的ＴＭＴＮＦ突变体（ＴＭＴＮＦｍ）。方法：应用ＲＴＰＣＲ技术，从人外周血单核细胞中扩增出编码ＴＭＴＮＦα的全长ｃＤＮＡ序列并构建ｐＢＳＫＴＮＦα重组体。以此为模板，借助改进的“一次重组ＰＣＲ”定位突变技术，造成ＴＭＴＮＦ转换为ＳＴＮＦ酶切位点的缺失，获得ＴＭＴＮＦ突变重组体（ＴＭＴＮＦｍ）。结果：将ＴＭＴＮＦｍｃＤＮＡ片段克隆至表达载体ｐＧＥＭ３Ｚｆ，利用体外转录翻译系统表达出具有生物学活性的跨膜突变型ＴＮＦα蛋白。经Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析证实，用胶原酶不能将ＴＭＴＮＦ突变体酶解成为ＳＴＮＦ。结论：提示所构建的ＴＭＴＮＦｍ去除了可转换为ＳＴＮＦ的酶解氨基酸序列，为进一步研究跨膜型ＴＮＦ杀瘤作用奠定了基础。

跨膜型TNF-α介导的反向信号对NK细胞杀伤功能的影响

目的观察跨膜型TNF-α介导的反向信号对NK细胞杀伤功能的影响。方法用sTNFRI激活NK92细胞的TM-TNF-α反向信号;MTT比色法检测NK92细胞对靶细胞的杀伤作用;β-己糖氨酶释放实验检测NK92细胞在杀伤靶细胞时的胞吐作用;ELISA实验检测NK92细胞sTNF-α的分泌;流式细胞术检测NK92细胞FasL的表达。结果预先激活TM-TNF-α反向信号,可以促进NK92细胞对靶细胞的杀伤功能;增强NK92细胞的胞吐;促进FasL的表达和sTNF-α的分泌。结论TM-TNF-α反向信号可能通过促进NK92细胞胞吐、sTNF-α分泌及FasL的表达而促进NK92细胞对靶细胞的杀伤。

跨膜型TNF-α突变体(Δ-28)的正向和反向信号对U937细胞的作用

目的观察跨膜段突变TM-TNF-α(Δ-28mTM-TNF-α)正反向信号诱导U937促炎因子表达的影响。方法Δ-28mTM-TNF-α质粒分别转染COS-7,检测表达的Δ-28mTM-TNF-α诱导U937产生NO的量。同样Δ-28mTM-TNF-α质粒转染U937,sTNFRI激活反向信号后,检测U937促炎因子IL-8以及IL-1β的mRNA转录水平。结果Δ-28mTM-TNF-α不能够诱导U937产生NO,但被激活并传递反向信号促使U937的促炎因子转录和表达。结论跨膜段突变抑制了TM-TNF-α正向信号但不影响反向信号的传递。

人跨膜型TNF-α(TM-TNF-α)特异性单克隆抗体的制备、鉴定及功能初探

目的:制备TM-TNF-α特异性单克隆抗体,并进行鉴定和初步功能分析。方法:用表位预测软件选定TM-TNF-α特异的20个氨基酸多肽,偶联载体蛋白,免疫BALB/c小鼠;用杂交瘤技术制备单克隆抗体。采用ELISA、流式细胞术和Western blot鉴定单抗的特异性,观察单抗对Jurkat细胞在AICD模型中凋亡率的影响。结果:成功制备了6株抗TM-TNF-α的单克隆抗体。ELISA结果显示6株单抗均特异性结合免疫原多肽,与S-TNF-α等细胞因子无交叉反应;流式细胞术显示6株单抗均能结合细胞膜表面TM-TNF-α分子,并可区分人源和鼠源TM-TNF-α;Western blot结果证实6株单抗只能识别26kD的人TM-TNF-α,而不识别17kD的S-TNF-α。在AICD模型中,单克隆抗体不影响Jurkat细胞凋亡率。结论:成功制备了6株TM-TNF-α特异性单克隆抗体,且单抗不干扰TNF-α与TNFR结合,为进一步研究TM-TNF-α在相关疾病中的作用提供又一研究手段。

抗鼠跨膜型TNF-α多克隆抗体设计和制备

目的:设计和制备区分鼠跨膜型肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和分泌型TNF-α的多克隆抗体.方法:采用抗原肽预测软件对跨膜型TNF-α表位进行预测,合成跨膜型TNF-α24个氨基酸多肽,并与匙孔碱血蓝蛋白偶联,家兔皮背部多点注射,收集分离血清,采用酶联免疫吸附试验和流式细胞术鉴定其特异性.结果:制备出高效价的抗血清,该抗血清可特异性结合免疫原多肽,不与分泌型TNF-α发生交叉反应,流式细胞术显示该抗血清可与细胞系NIH 3T3表达的跨膜型TNF-α发生特异性结合.结论:成功制备了跨膜型TNF-α特异性多克隆抗体,为区分跨膜型TNF-α和分泌型TNF-α生物学作用提供了新工具.

人肺癌组织跨膜型TNF-α较分泌型TNF-α增多

肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）是炎性反应和肿瘤重要的连接分子之一。TNF-α分为跨膜型TNF-α（transmembrane TNF-α,tm TNF-α）和分泌型TNF-α（soluble TNF-α,s TNF-α）。既往更多研究集中在s TNF-α,而tm TNF-α在肺癌中的作用未见报道。

急性肝组织损伤跨膜型肿瘤坏死因子α表达变化及意义

目的探讨急性肝组织损伤跨膜型肿瘤坏死因子α(tmTNF-α)表达变化及其与肝组织损伤的关系。方法用脂多糖(LPS)和D-氨基半乳糖(D-gal)建立鼠急性肝损伤模型,采用免疫组化检测肝组织tmTNF-α的表达,HE染色检测肝组织损伤;采用蛋白酶法分离肝脏库普弗细胞(KCs),以CD11b和F4/80为标志,采用流式细胞术鉴定KCs,同时检测LPS/D-gal处理后不同时间KCs tmTNF-α表达水平。结果 LPS/D-gal处理后6h,肝组织tmTNF-α表达显著增加,tmTNF-α主要来源于KCs;tmTNF-α表达与肝组织损伤是一致的。结论tmTNF-α表达与严重肝组织损伤密切相关。

R31L TNF-α突变体重组质粒的构建、真核表达及其产物的胞毒效应

目的:研究膜型、分泌型TNF-α的31位氨基酸在其生物学效应中的作用,进一步探讨TNF-α结构与生物学效应的关系。方法:采用重叠PCR方法将wt TNF-α31位精氨酸(R)密码子(CGC)定点突变替换成亮氨酸(L)密码子(CTC),构建R31L TNF-α-pcDNA3.0重组质粒,经酶切、PCR及DNA测序鉴定后,采用脂质体转染法将其瞬时转染COS-7细胞进行表达,通过MTT法检测R31LTNF-α突变体的胞毒效应。结果:酶切、PCR及测序鉴定证实目的基因R31LTNF-α正确连接到pcDNA3.0的多克隆位点;TNF-α31位突变可增强sTNF-α的胞毒效应,突变体的CC50值是野生型的1/10,而对mTNF-α的生物学效应无明显影响。结论:本实验成功地构建了R31L TNF-α-pcDNA3.0重组质粒,且在真核细胞COS-7中获得表达;TNF-α31位置换成亮氨酸后,主要增强其分泌型分子的胞毒效应,而对其膜分子无作用。

稳定高效表达TNF-α基因及其突变体的H22肿瘤细胞株的建立

目的建立转染3种TNF-α基因(分泌型TNF-α突变体、跨膜型TNF-α突变体和野生型TNF-α的H22细胞株,以比较不同类型TNF-α的杀瘤效应。方法采用逆转录病毒载体,将3种TNF-α基因导入小鼠H22肿瘤细胞中,用Southern印迹、RT-PCR、流式细胞术和生物学活性检测等方法,从基因的整合、RNA转录、蛋白的表达及其生物学活性4个方面,对转染细胞进行检测鉴定。结果3种TNF-α基因均在H22细胞中得到有效表达,并具有生物学活性。结论获得3种稳定高效表达TNF-α的H22肿瘤细胞株,为进一步研究跨膜型和分泌型TNF-α体内的抑瘤效应建立了良好的实验模型。

转染TNF-α及其突变体的成纤维细胞的杀瘤效应

目的 :比较跨膜型和分泌型TNF α在体内的抗瘤效应。方法 :将 3种TNF α基因 (分泌型TNF α突变体 ,S TN Fm、跨膜型TNF α突变体 ,TM TNFm和野生型TNF α,Wt TNF)通过逆转录病毒载体转染成纤维细胞NIH/3T3 ;并用Southern印迹、RT PCR、流式细胞仪和生物活性检测等方法 ,从基因的整合、RNA转录、蛋白的表达及其生物学活性 4个方面对转染细胞进行检测鉴定。在小鼠接种肿瘤细胞的第 3天 ,于接种部位分别皮下注射表达TNF α及其突变体的NIH3T3细胞 ,效 /靶比为5∶1或 1∶1 ,观察这 3种TNF α的体内抗瘤效应。结果 :NIH3T3转染细胞可表达高水平的TNFα及其突变体。在体外 ,NIH3T3/TM TNFm的固定细胞、NIH3T3/S TNFm的上清、NIH3T3/Wt TNF的固定细胞和上清均可有效杀伤肿瘤细胞H2 2。在体内 ,当效 /靶比为 5∶1时 ,注射NIH3T3/TM TNFm的抑瘤效果最强 ;而当效 /靶比为 1∶1时 ,则NIH3T3/S TNFm的疗效最好。此外 ,在过继治疗期间未见明显副作用。结论 :上述结果提示跨膜型和分泌型TNF α均可在体内有效杀瘤 ;但如效 /靶比适当 ,TM TNF α显示的杀瘤效应较S TNF

两型TNF-α的细胞毒效应与靶细胞内Ca^(2+)浓度变化的关系

目的 :比较分泌型TNF α(S TNF α)和跨膜型TNF α(TM TNF α)发挥细胞毒效应时 ,引起靶细胞内Ca2 + 浓度的变化。方法 :采用生物学活性检测法 ,观察两型TNF α对不同靶细胞的杀伤效应 ;用Fura 2检测细胞内Ca2 + 浓度的变化。结果 :TM TNF α可杀伤实验所用 6株靶细胞 ;而S TNF α则仅对其中两株有细胞毒效应。两型TNF α杀伤靶细胞时 ,均伴有明显的Ca2 + 浓度升高。用钙螯合剂EGTA(10mmol/L)预先处理靶细胞30min ,只能降低S TNF α作用的靶细胞内的Ca2 + 浓度 ,并使其细胞毒效应明显减弱 (P <0 .0 1) ;对TM TNF α无影响。结论 :两型TNF α发挥细胞毒效应时 ,均可引起靶细胞内钙离子的重分布 ,导致靶细胞内Ca2 + 浓度的升高 ,但S TNF α的作用还可能与促进胞外Ca2 +

TM-TNF-α模拟肽P18和S-TNF模拟肽P12的体外生物学活性的鉴定

目的:获得具有生物学活性的跨膜型TNF-α(TM-TNF-α)模拟肽。方法:以噬菌体扩增及PEG/NaCl沉淀法, 大量制备所需的噬菌体展示肽。采用细胞毒实验、RT-PCR、Western blot印迹、凋亡检测实验分别检测TM-TNF-α模拟肽的杀瘤效应、对SODD mRNA表达水平、NF-κB核转位及致死亡方式的影响。结果:噬菌体展示肽P12和P18分别能模拟sTNF-α和 TM-TNF-α的生物学活性。结论:获得能模拟TM-TNF-α的生物学活性的展示肽,为TM-TNF-α用于临床抗瘤治疗提供新线索。

乳腺癌NFAT对tmTNF-α基因转录的调节作用

目的研究乳腺癌NFAT对跨膜型肿瘤坏死因子α(tmTNF-α)基因转录的调节作用。方法构建质粒,FACS检测内源性tmTNF-α的表达,Western blot检测内源性NFAT的活化;采用Ch IP法对人的乳腺癌细胞系MDA-MB-231和MCF-7分析NFAT1对tmTNF-α启动子的结合;给予低表达tmTNF-α的乳腺癌细胞系MCF-7 NFAT的刺激剂PMA/iono以促进其入核活化;给予高表达tmTNF-α的乳腺癌细胞系MDA-MB-231NFAT的抑制剂VIVIT以阻止其入核。结果人乳腺癌细胞MDA-MB-231高表达tmTNF-α(89.2%),而MCF-7几乎不表达tmTNF-α(1.0%);高表达tmTNF-α的MDA-MB-231细胞中不仅存在细胞浆中表达的非活化蛋白pNFAT1,在细胞核中也检测到其活化形式蛋白NFAT1;而在MCF-7中没有检测到NFAT1活化蛋白的表达;根据特异性启动子引物,MDA-MB-231的染色质样品可检测到相应的目的片段,说明该细胞系中存在NFAT1对tmTNF-α启动子的结合。而在MCF-7中没有出现可看到的目的片段。Western blot检测到tmTNF-α的表达显著增加,提示在乳腺癌细胞MCF-7,PMA/iono可促进NFAT活化,通过对转录活性的调节促进tmTNF-α的表达;给予高表达tmTNF-α的乳腺癌细胞系MDA-MB-231NFAT的抑制剂VIVIT以阻止其入核,Western blot检测到tmTNF-α的表达明显减少。结论可通过抑制NFAT1来影响tmTNF-α的表达。

比较跨膜型和分泌型TNF-α的体内杀瘤效应及其机制

目的 比较跨膜型和分泌型TNF α在体内的抗瘤作用及机制。方法 在小鼠接种肿瘤细胞H2 2第 3天 ,于肿瘤接种部位分别皮下注射插入TNF α及其突变体基因的质粒DNA(分泌型TNF突变体、跨膜型TNF突变体和野生型TNF α) ,观察肿瘤的生长情况 ,并用TUNEL检测肿瘤细胞是否发生凋亡 ;用免疫组化检测肿瘤局部淋巴细胞浸润和肿瘤组织表达的Fas和CD44V3。结果 TNF α及其突变体均可被肿瘤细胞有效表达 ,并都可明显抑制肿瘤的生长 (P <0 .0 1) ,其中跨膜型TNF突变体抑瘤作用最强 ,可促进肿瘤表达Fas ,引起肿瘤细胞发生明显凋亡 ,同时抑制其表达CD44V3(P <0 .0 1) ;而分泌型TNF则可诱导肿瘤局部大量淋巴细胞 (CD4+、CD8+)浸润 (P <0 .0 1) ,并引起肿瘤组织出血坏死。结论 直接注射跨膜型和分泌型TNF α裸DNA均可在体内有效杀瘤。跨膜型TNF的体内杀瘤机制可能不同于分泌型TNF ,前者可直接和通过Fas途径间接诱导瘤细胞凋亡 ;

跨膜型和分泌型TNF-α在内毒素性休克过程中的作用

目的 研究跨膜型TNF α(mTNF α)的消长与内毒素性休克发生、发展的关系 ,探讨mTNF α在内毒素性休克中的作用和机理。方法 首先使用埃希大肠杆菌死菌液制备大鼠内毒素性休克模型 ,并分不同时间点检测血清中的分泌型TNF α(sTNF α)、腹腔巨噬细胞表面上的mTNF α。然后 ,在给大鼠注射死菌液之前 30min ,分别注射TNF转化酶 (TACE)反义寡核甘酸 (5mg/kg)或抗TNF α多克隆抗体 (5mg/kg)。 6h后分别检测sTNF α、mTNF α水平 ;检查肺、肾等内脏器官的病理改变 ;并且监测各组大鼠的血压变化。结果 在内毒素性休克过程中 ,mTNF α表达的动态变化不同于sTNF α ,mTNF α在注射菌液 30min后开始升高 ,4 .5h达最高峰 ,随后有所下降 ,但一直维持在较高水平。TACE反义寡核苷酸能有效地抑制mTNF α转化为sTNF α ,使腹腔巨噬细胞表面上的mTNF α表达明显增高 (P <0 .0 0 1) ,使血压维持在正常水平 ,肺、肾等脏器无病理改变 ;抗TNF α多克隆抗体能中和sTNF α,其结果与前者基本相似。结论 内毒素性休克的病理过程主要与sTNF α及其诱导的其它促炎细胞因子如IL 1β、IL 6、IL 8等有关 ,而mTNF α则可抵抗内毒素的攻击 ,稳定血压 ,限制炎症反应及保护组织免受损伤 ,为临床治疗休克和感染性疾病提供了新的线索和实?

跨膜型TNF-α单克隆抗体腺病毒表达载体的构建和鉴定

目的:应用AdEasy-1系统构建包含tmTNF-α单克隆抗体轻、重链序列的重组腺病毒表达载体。方法:首先PCR合成抗体轻、重链序列,分别将轻、重链序列插入经过改造的含有双启动子的穿梭质粒pShuttle-2CMV,将穿梭载体电转化转化AdEasy系统BJ5183感受态,挑取单克隆扩增质粒后酶切鉴定。结果:成功构建重组腺病毒表达载体pAdEasy-tmTNF-α,抗体重链、轻链序列酶切后经1%琼脂糖凝胶电泳证实条带片段大小正确,电转化BJ5183后挑选重组克隆提取质粒,PacI酶切后重组片段位于4.5kb及3 kb位置,证明重组腺病毒质粒pAdeasy-1-tmTNF-α构建成功。结论:将腺病毒系统与单克隆抗体技术相结合,利用AdEasy-1系统成功构建腺病毒重组tmTNF-α单克隆抗体表达载体,为进一步开展肿瘤基因治疗的研究提供基础。

跨膜型TNF-α与NF-κB在三阴性乳腺癌中的表达及其意义

目的:探讨跨膜型TNF-α与磷酸化NF-κB在三阴性乳腺癌(TNBC)中的表达及其临床意义。方法:采用免疫组化法检测52例三阴性乳腺癌与30例非三阴性乳腺癌组织中跨膜型TNF-α与磷酸化NF-κB的表达,并分析其与三阴性乳腺癌各临床指标的相关性。结果:跨膜型TNF-a与磷酸化NF-κB在三阴性乳腺癌中的阳性表达率分别为82.7%(43/52)和67.3%(35/52),均显著高于非三阴性乳腺癌,差异具有统计学意义(P<0.05)。在三阴性乳腺癌中,跨膜型TNF-α及磷酸化NF-κB的表达与肿瘤大小和淋巴结转移与否显著相关(P<0.05),且跨膜型TNF-α与磷酸化NF-κB的表达呈显著正相关(P<0.05)。结论:跨膜型TNF-α及磷酸化NF-κB高表达可能预示着TNBC更差的化疗敏感性和预后,有望成为TNBC预后的重要预测因子。跨膜型TNF-α通过激活磷酸化NF-κB激活其下游的抗凋亡和促增殖因子,与三阴性乳腺癌的发生发展有关。

TNFR2基因敲除小鼠H22移植瘤生长特点和Treg数量与功能检测

目的观察tm TNF-α/TNFR2信号轴对荷瘤鼠肿瘤生长影响及其机制。方法采用Western blot检查H22荷瘤鼠肿瘤微环境中Treg细胞TNFR1及TNFR2的表达。TNFR2敲除BALB/c小鼠和野生型鼠各10只,在TNFR2敲除的BALB/c小鼠皮下接种H22肝癌细胞株,观察肿瘤直径及肿瘤微环境中Treg的募集数量,同时以野生型小鼠做对照。用tm TNF-α刺激Treg细胞,ELISA检测上清IL-10和TGF-β的含量。结果荷瘤鼠微环境中Treg细胞TNFR2表达明显高于野生型小鼠脾脏Treg细胞(P<0.05),而TNFR1表达未见明显变化;TNFR2基因敲除鼠肿瘤直径明显低于野生型小鼠(P<0.05),且肿瘤微环境中Treg细胞数量也明显少于野生型小鼠(P<0.05)。在体外tm TNF-α可以促进Treg细胞产生IL-10和TGF-β(P<0.05)。结论 TNFR2基因敲除小鼠肿瘤生长减缓,肿瘤局部微环境中Treg细胞减少,同时tm TNF-α能够刺激Treg细胞释放抑炎因子IL-10和TGF-β,增强其免疫抑制功能。

利用噬菌体肽库筛选TNF-α表位的相关短肽

目的 从噬菌体肽库筛选TNF α相关短肽 ,为临床上治疗肿瘤奠定基础。方法 用可溶性TNF受体Ⅰ (sTNFRⅠ )筛选噬菌体随机 12肽库 ,利用细胞毒效应进行生物学效应筛选 ,再进行单链DNA测序。结果 分别得到若干模拟跨膜型TNF α(TM TNF α)和模拟分泌型TNF α(S TNF α)细胞毒效应的短肽 ,选择细胞毒效应最好的模拟TM TNF α短肽进行人工合成 ,体外实验显示此肽段对S TNF α耐受肿瘤细胞系HL 6 0具有明显细胞毒效应 ,且主要引起靶细胞凋亡。另外 ,利用激光共聚焦显微镜证实该合成肽段不能诱导NF κB发生核转位。结论 获得模拟TM TNF α的短肽 ,为TM TNF α用于临床抗瘤治疗提供新线索。