高效液相色谱法测定跳骨片中士的宁的含量

目的：建立跳骨片中士的宁的含量测定方法。方法：采用高效液相色谱法。C18色谱柱（4．6mm×150mm，5μm）；流动相为0．01mol·L^-1醋酸铵-甲醇-三乙胺（81：19：0．5．用冰醋酸调pH值3．8）；检测波长为254nm。结果：士的宁在0．198～1．185μg范围内进样量与峰面积呈良好的线性关系。r=0．9997．平均回收率为99．24％，RSD为0.87％。结论：该方法简单可行，重现性好，可用于跳骨片的质量控制。

跳骨片抑制大鼠膝骨关节炎Wnt/β-catenin信号转导通路介导炎症反应的机制研究

目的探讨跳骨片对大鼠膝骨关节炎(OA)Wnt/β-catenin信号转导通路介导炎症反应的机制。方法将30只8周龄雄性SD大鼠随机分为空白组、模型组、跳骨片组,每组10只。空白组不予任何处理,模型组、跳骨片组均采用改良Hulth法建立OA动物模型。建模成功后跳骨片组每天予跳骨片0.32 g/kg灌胃,空白组和模型组每天予等量生理盐水灌胃,干预12周后分别取3组大鼠双侧膝关节股骨髁、关节软骨和滑膜,将股骨髁常规固定、脱钙、包埋及切片,对切片分别进行苏木精-伊红(HE)、甲苯胺蓝染色,光镜下观察关节软骨组织形态学变化;酶联免疫吸附测定(ELISA)检测滑膜中白细胞介素(IL)-1β、基质金属蛋白酶(MMP)-13、肿瘤坏死因子(TNF)-α含量;蛋白质免疫印迹检测关节软骨β-catenin、Wnt-4蛋白表达。结果模型组滑膜中,IL-1β表达量明显高于空白组和跳骨片组(P<0.01),MMP-13表达量高于空白组和跳骨片组(P<0.05),TNF-α表达量明显高于空白组(P<0.01)、高于跳骨片组(P<0.05);模型组关节软骨中,β-catenin蛋白表达量明显高于空白组和跳骨片组(P<0.01),Wnt-4蛋白表达量高于空白组和跳骨片组(P<0.05)。HE染色显示跳骨片组软骨破坏程度低于模型组,甲苯胺蓝染色显示跳骨片组软骨细胞蛋白多糖含量高于模型组(P<0.01)。结论跳骨片能抑制关节软骨Wnt/β-catenin信号转导通路,降低滑膜中IL-1β、MMP-13、TNF-α表达,抑制炎症反应介导的软骨基质降解,延缓关节软骨退变。

跳骨片含药血清抑制脂多糖诱导的软骨细胞炎症反应的作用机制研究

目的:探讨跳骨片含药血清抑制脂多糖诱导的软骨细胞炎症反应的作用机制。方法:将10只8周龄雄性SD大鼠随机分为跳骨片组和空白组,跳骨片组以0.32 g·kg-1剂量的跳骨片灌胃,空白组给予等量生理盐水灌胃;每天灌胃1次,连续7 d;末次灌胃1 h后,经腹主动脉取血,分别制备跳骨片含药血清和空白血清,低温保存备用。从10只4周龄SD大鼠膝关节软骨中分离软骨细胞并培养,光学显微镜下观察软骨细胞形态,并用Ⅱ型胶原酶免疫组化鉴定。将培养好的第2代软骨细胞随机分为空白血清组、模型组、跳骨片含药血清组,其中空白血清组以含10%空白血清的培养基(dulbecco modified eagle medium,DMEM)培养;模型组以浓度为10 ng·mL-1的脂多糖和含10%空白血清的DMEM培养;跳骨片含药血清组以浓度为10 ng·mL-1的脂多糖和含10%跳骨片含药血清的DMEM培养;3组均连续干预培养8 h,采用酶联免疫吸附法检测软骨细胞基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)3、MMP9含量,采用荧光定量RT-PCR法检测软骨细胞中Wnt/β-catenin信号通路相关基因表达水平,采用Western blot法检测软骨细胞中β-链蛋白(β-catenin)、卷曲蛋白-2(Frizzled-2)的蛋白表达量,采用免疫荧光检测法检测软骨细胞中β-catenin、糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthasc kinase-3β,GSK-3β)、蛋白多糖1(proteoglycans 1,PGS1)的蛋白表达量。结果:(1)软骨细胞免疫组化鉴定结果。第2代软骨细胞胞浆及细胞膜呈棕黄色阳性染色,具有典型的软骨细胞生物学特征。(2)软骨细胞MMP3、MMP9含量。脂多糖干预8 h后,空白血清组、模型组和跳骨片含药血清组的软骨细胞MMP3、MMP9含量比较,组间差异均有统计学意义[(34.019±1.036)ng·mL-1,(44.645±2.473)ng·mL-1,(32.941±1.792)ng·mL-1,F=36.060,P=0.000;(1.348±0.038)ng·mL-1,(1.562±0.112)ng·mL-1,(1.331±0.015)ng·mL-1,F=11.319,P=0.000];模型组软骨细胞MMP3、MMP9含量均高于空白血清组(LSD-t=-7.016,P=0.000;LSD-t=-3.768,P=0.003);跳骨片含药血清组软骨细胞MMP3、MMP9含量均低于模型组(LSD-t=7.652,P=0.000;LSD-t=4.066,P=0.002);空白血清组软骨细胞MMP3、MMP9含量与跳骨片含药血清组比较,差异均无统计意义(LSD-t=0.635,P=0.549;LSD-t=0.299,P=0.770)。(3)软骨细胞中Wnt/β-catenin信号通路相关基因的表达。脂多糖干预8 h后,空白血清组、模型组和跳骨片含药血清组软骨细胞中β-catenin、GSK-3β、Frizzled-2、Wnt-4、CKI-ε基因表达量比较,组间差异均有统计学意义(1.000±0.275,2.258±0.206,1.431±0.304,F=36.709,P=0.000;1.000±0.133,0.417±0.104,0.842±0.094,F=29.259,P=0.000;1.000±0.191,1.737±0.238,1.445±0.337,F=7.027,P=0.015;1.000±0.341,3.801±0.579,1.876±0.388,F=71.903,P=0.000;1.000±0.309,2.208±0.708,1.441±0.421,F=64.178,P=0.000);模型组软骨细胞中β-catenin、Frizzled-2、Wnt-4、CKI-ε基因表达量均高于空白血清组(LSD-t=-8.431,P=0.000;LSD-t=-3.723,P=0.005;LSD-t=8.062,P=0.000;LSD-t=-11.235,P=0.000),GSK-3β基因表达量低于空白血清组(LSD-t=7.397,P=0.000);跳骨片含药血清组软骨细胞中β-catenin、Frizzled-2、Wnt-4、CKI-ε基因表达量均低于模型组(LSD-t=5.541,P=0.000;LSD-t=1.477,P=0.017;LSD-t=8.062,P=0.000;LSD-t=6.882,P=0.000),GSK-3β基因表达量高于模型组(LSD-t=-5.387,P=0.000);空白血清组软骨细胞中β-catenin、Wnt-4、CKI-ε基因表达量均低于跳骨片含药血清组(LSD-t=-2.289,P=0.018;LSD-t=-3.658,P=0.005;LSD-t=-4.352,P=0.002);空白血清组软骨细胞中GSK-3β、Frizzled-2基因表达量与跳骨片含药血清组比较,差异均无统计学意义(LSD-t=2.009,P=0.075;LSD-t=-3.658,P=0.051)。(4)软骨细胞中β-catenin、Frizzled-2的蛋白表达。脂多糖干预8 h后,空白血清组、模型组和跳骨片含药血清组软骨细胞中β-catenin、Frizzled-2蛋白表达量比较,组间差异均有统计学意义(0.449±0.063,0.746±0.156,0.549±0.056,F=5.323,P=0.026;1.348±0.038,1.562±0.112,1.331±0.015,F=6.291,P=0.034);模型组软骨细胞中β-catenin、Frizzled-2蛋白表达量高于空白血清组(LSD-t=-11.235,P=0.005;LSD-t=-3.104,P=0.021);跳骨片含药血清组软骨细胞中β-catenin、Frizzled-2蛋白表达量低于模型组(LSD-t=6.883,P=0.037;LSD-t=3.039,P=0.023);空白血清组软骨细胞中β-catenin蛋白表达量低于跳骨片含药血清组(LSD-t=-4.352,P=0.002);空白血清组软骨细胞中Frizzled-2蛋白表达量与跳骨片含药血清组比较,差异无统计学意义(LSD-t=-0.065,P=0.950)。(5)软骨细胞中β-catenin、GSK-3β、PGS1的蛋白表达。脂多糖干预8 h后,软骨细胞中β-catenin、GSK-3β、PGS1蛋白染色明显,呈绿色;空白血清组、模型组和跳骨片含药血清组软骨细胞中β-catenin、GSK-3β、PGS1蛋白表达量比较,组间差异均有统计学意义(0.014±0.002,0.029±0.006,0.018±0.002,F=9.910,P=0.013;0.380±0.011,0.237±0.015,0.287±0.002,F=56.639,P=0.000;0.034±0.003,0.022±0.002,0.029±0.003,F=27.232,P=0.001);模型组软骨细胞β-catenin蛋白表达量高于空白血清组(LSD-t=-4.103,P=0.006),GSK-3β、PGS1蛋白表达量低于空白血清组(LSD-t=1.048,P=0.000;t=7.365,P=0.000);跳骨片含药血清组软骨细胞β-catenin蛋白表达量低于模型组(LSD-t=-3.548,P=0.012),GSK-3β、PGS1蛋白表达量高于模型组(LSD-t=-3.657,P=0.011;LSD-t=-3.273,P=0.017);空白血清组软骨细胞中β-catenin蛋白表达量与跳骨片含药血清组比较,差异无统计学意义(LSD-t=-0.554,P=0.599);空白血清组软骨细胞中GSK-3β、PGS1蛋白表达量高于跳骨片含药血清组(LSD-t=6.827,P=0.000;LSD-t=4.092,P=0.010)。结论:跳骨片含药血清可以抑制脂多糖诱导的软骨细胞炎症反应,延缓关节软骨退变。其作用机制可能与Wnt/β-catenin信号通路的调控有关,其中β-catenin、Frizzled-2、GSK-3β、Wnt-4、CKI-ε基因可能是该信号通路的重要靶点。但是由于引起OA的因素众多且跳骨片含药血清成分多且复杂,有待于进一步研究证实。

跳骨片水提物对体外大鼠关节软骨细胞活性的影响

目的:探讨跳骨片水提物对体外大鼠关节软骨细胞活性的影响。方法:4周龄SPF级SD大鼠5只,采用机械-Ⅱ型胶原酶消化法获取膝关节软骨细胞,倒置相差显微镜观察软骨细胞的形态结构,Ⅱ型胶原免疫组化染色鉴定软骨细胞。0,25,50,100μg·mL^(-1)跳骨片水提物对第3代软骨细胞,分别干预24,48,72 h后,MTT法检测细胞活性。结果:1Ⅱ型胶原免疫组化染色后软骨细胞胞浆呈棕黄色,为阳性;2以0μg·mL^(-1)跳骨片水提物干预的软骨细胞作为对照组,干预24 h后,50μg·mL^(-1)组软骨细胞活性明显高于对照组(P<0.05);干预48 h后,25,50μg·mL^(-1)组明显高于对照组(P<0.05);干预72 h后,25,50,100μg·mL^(-1)组与对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论:跳骨片水提物在25,50,100μg·mL^(-1)时均可以促进软骨细胞的增殖,具有剂量和时间依赖性,其中50μg·mL^(-1)干预24 h后最为明显。

跳骨片质量控制方法的研究

目的 研究跳骨片质量控制方法 ,为制定跳骨片质量标准打下基础。方法 采用薄层色谱法对本品 4种药物进行定性鉴别 ,采用气相色谱法测定冰片的含量 ,薄层扫描法测定马钱子中士的宁、马钱子碱的含量。结果 4种药物薄层定性条件合适 ,斑点清晰 ,冰片、士的宁、马钱子碱含量测定条件稳定 ,灵敏度高 ,测定结果准确 ,重现性好。

跳骨片质量标准的研究

目的提高跳骨片的质量标准。方法采用TLC法对制剂中的麸炒枳壳和骨碎补进行了定性研究，采用HPLC法测定跳骨片中士的宁的含量。结果在0.1194-1.194μg范围内，士的宁进样量与峰面积响应值呈良好的线性关系，r=0.9999；平均回收率为98.5％，RSD=1.3％。结论本法准确灵敏可有效控制产品质量。

跳骨片不同极性部位对软骨细胞活性的影响研究

目的:研究跳骨片不同极性部位对软骨细胞活性的影响。方法:用跳骨片的水提物、醇提物、多糖以及醇提物的石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取物及残留的水相共8个组分干预体外培养的软骨细胞,采用MTT法检测不同极性部位作用48h后软骨细胞的活性。结果:在一定剂量范围内,跳骨片的水提物、多糖,醇提物的乙酸乙酯萃取部位和水相干预组软骨细胞的活性增强,醇提物以及醇提物的石油醚、氯仿和正丁醇萃取部位干预组软骨细胞的活性降低。结论:跳骨片的水提物、多糖和醇提物的乙酸乙酯萃取及残留的水相部位能够促进软骨细胞的增殖,为跳骨片的有效部位。

单边外固定支架合跳骨片治疗胫腓骨粉碎骨折的临床疗效观察

目的 通过观察单边外固定支架合跳骨片治疗胫腓骨粉碎性骨折的临床疗效 ,探索胫腓骨粉碎骨折的有效疗法。方法 用单边外固定支架合跳骨片与交锁髓内钉分别治疗胫腓骨粉碎骨折并进行比较。结果 外固定组病人骨折处出现骨痂及骨性愈合时间均比髓内钉组病人早 (P <0 0 1)。结论 对易发生骨折不愈合的胫腓骨粉碎骨折 ,使用单边外固定支架合跳骨片治疗比交锁髓内钉内固定治疗能更早出现骨痂 ,更利于骨折愈合。

跳骨片致不良反应汇总报告及分析

目的汇总并分析跳骨片导致不良反应的具体临床特征,为临床安全、有效的使用该药提供安全性信息参考。方法搜集并分析2016年度我院发现并上报的跳骨片导致不良反应3例临床资料,汇总并分析跳骨片导致不良反应的原因及预后信息。结果跳骨片所致不良反应主要体现在皮肤及附件损害以及消化道损害方面。结论跳骨片临床用药安全有效,但仍有导致不良反应出现的可能;提高安全用药意识,关注用药教育,可积极预防不良反应的发生。

改进型跳骨片治疗骨伤科疾患45例临床观察

跳骨片处方中主药马钱子由尿泡砂炒改变为砂烫,用量由55g 减为10g,其生物碱含量不变,应用于骨折、脱位、伤筋、内伤等疾病,具有止、痛消肿、祛瘀、续骨、舒筋等功用,疗效显著,总有效率达95.6％,未见明显毒副作用,是骨伤科疾病之良药。

跳骨片调控Wnt/β-catenin信号通路延缓骨关节炎关节软骨退变的机制研究

目的:探讨跳骨片调控Wnt/β-连环蛋白(β-catenin)信号通路保护骨关节炎关节软骨的机制。方法:将30只2月龄雄性SD大鼠随机分为空白对照组、模型对照组、跳骨片组,每组10只。采用改良Hulth法建立骨关节炎动物模型。造模成功后跳骨片组给予跳骨片0.32 g·kg^(-1)·d^(-1)灌胃,空白对照组和模型对照组给予等量生理盐水灌胃,干预12周后取大鼠关节软骨。Real-time PCR检测关节软骨β-catenin、Frizzled-2、GSK-3β、CKIεmRNA表达,Western blot法检测关节软骨CKIε、CollagenⅡ、PGS1蛋白表达,Massion染色法观察3组关节软骨胶原的表达及形态变化。结果:Real-time PCR结果显示,与空白对照组比较,模型对照组关节软骨β-catenin、Frizzled-2、CKIεmRNA表达明显上升(P <0.05,P> 0.05,P <0.05),而GSK-3βmRNA表达明显下降(P <0.05);与模型对照组比较,跳骨片组关节软骨β-catenin、Frizzled-2、CKIεmRNA表达明显下降(P <0.05,P> 0.05,P <0.05),而GSK-3βmRNA表达明显上升(P <0.05)。Western blot结果显示,与空白对照组比较,模型对照组关节软骨CKIε蛋白表达明显升高(P <0.05),而CollagenⅡ、PGS1蛋白表达明显降低(P <0.05,P <0.01);与模型对照组比较,跳骨片组关节软骨CKI-ε蛋白表达明显降低(P <0.05),CollagenⅡ、PGS1蛋白表达明显升高(P <0.01,P> 0.05)。Massion染色结果显示,空白对照组和跳骨片组关节软骨结构清晰,软骨层染色明显,软骨组织呈淡蓝色,胶原含量较高;模型对照组软骨层结构紊乱,染色较浅,胶原含量低。结论:跳骨片能调控Wnt/β-catenin信号通路抑制骨关节炎炎症反应,促进细胞外基质的合成,保护关节软骨。

高效液相色谱法测定跳骨片中士的宁的含量

目的：应用高效液相色谱法测定跳骨片中士的宁的含量。方法：采用Shim-pack-C18柱（5μm,150 mm×4.6 mm）;乙腈-0.01 mol/L庚烷磺酸钠与0.02 mol/L磷酸二氢钾等量混合溶液（用10%磷酸调节pH值2.8）（21∶79）为流动相;流速1 mL/min;检测波长为260 nm;柱温：30℃。结果：士的宁线性范围为0.1304~0.652μg,r=0.9998,回收率为97.97%,RSD=0.90%。结论：该方法操作简便、准确、灵敏,可用于该制剂的质量控制。

跳骨片中砂烫马钱子用量的研究

对跳骨片处方中的马钱子分别用尿泡砂炒和砂烫两种方法进行炮制。通过测定炮制品中番木鳖碱的含量和跳骨片 LD_(50)的测定,调整了跳骨片处方中砂烫马钱子的用量,说明番木鳖碱的含量是控制马钱子炮制品质量的关键。

原子荧光光度法测定跳骨片中可溶性砷、汞含量

目的建立测定跳骨片中可溶性砷、汞含量的原子荧光光度法。方法汞测定条件,总灯电流为30 mA,光电倍增管负高压为210 V,原子化器高度为10 mm,载气流量为40 mL/min,屏蔽气流量为1000 mL/min,水浴恒温振荡仪温度为(37±1)℃;砷测定条件,总灯电流为60 mA,光电倍增管负高压为240 V,其余同汞测定条件。结果砷和汞进样量在0~40 ng范围内与荧光强度值线性关系良好,平均回收率分别为98.90%和100.08%,RSD分别为1.43%和3.21%(n=6),精密度试验的RSD均小于1%(n=7)。结论该方法操作简便、结果准确、重复性好,可真实模拟体内环境,准确测定可溶性砷、汞的含量。

跳骨片马钱子碱径向薄层层析法

跳骨片(丹)记载于古方外科十三方考,是治疗骨折、脱臼、跌打损伤之名药,马钱子是该方之君药,有毒,对药片马钱子碱含量测定是跳骨片的重要质控指标。本文探索用HPTLC—UV分析法测定跳骨片马钱子碱含量,为跳骨片的质控提供方法和基本数据。实验部分一、仪器、药品与试剂 CS—920薄层扫描仪系日本岛津公司产品。展开槽(for 20×10cm)。

跳骨片中马兜铃酸A的HPLC限量检查

目的建立测定跳骨片中马兜铃酸A的高效液相色谱的分析方法。方：法采用RP-HPLC法测定。用NovapakC18色谱柱（250mm×4．6mm，5岬），以已腈一甲醇-1％冰醋酸溶液（28：28：44）为流动相，流速为lmL·min-1，检测波长390rim，柱温为宣温。进样量为5“k结果马兜铃醢A的保留时问约为14．7min，与其他峰的分离度大干1．5。马兜铃酸A的线性范围为0．49869ug·mL-1～3．49083ug·mL-1，y=0．9998，最低检测限为4．128×10_。pg（信噪比为5：1），平均回收率为97．89％（n=5）。结论＂ig7Y：,-k简便快速．灵敏度高，结果准确可靠，可用于跳骨片中马兜铃酸A的含量测定，跳骨片中马兜铃酸A未检出。

RP-HPLC法测定跳骨片中柚皮苷的含量

目的 建立一种高效液相色谱法测定跳骨片中柚皮苷的舍量。方法 采用反相液相色谱法，以ODS C18柱（250mm×4．6mm，5μm）柱为色谱柱；流动相为乙腈-0．1％磷酸（20：80）；流速为1．0mL·min^-1；检测波长为284nm。结果 抽皮苷在0．09936～0．9936μg范围内，进样量与峰面积呈良好的线性关系（r=0．9992）。平均回收率为97．62%，RSD=0．43％。结论 本法快速简便准确，可用于跳骨片的质量控制。

跳骨片中马兜铃酸A的限量测定

目的：研究跳骨片中马兜铃酸A的限量测定方法.方法：色谱柱为Shimpack Vp-ods （4.6mm×15cm）C18柱,流动相为：甲醇-1％冰醋酸（51：49）;流速：1.0mL/min,检测波长为260nm.结果：进样量在20.04～1 282.5ng范围内与峰面积呈良好线性关系（r=0.999 98）;平均回收率为98.50％,RSD为0.74％（n=6）.经HPLC含量测定,其马兜铃酸A的含量极低（2～20μg·g^-1）.对10批成品进行检测,其含量均小于20ppm,参照ICH对氯仿残留的限定,浓度限定＜60ppm,PED＜0.6mg/d,本产品马兜铃酸A含量低于该限度.结论：该法简便准确,结果可靠,可用于测定跳骨片中马兜铃酸A的限量.