车前草花叶病毒衣壳蛋白的原核表达和多克隆抗体制备

为制备车前草花叶病毒(Plantago asiatica mosaic virus,PlAMV)衣壳蛋白(capsid protein,CP)及其多克隆抗体,采用RT-PCR方法从甘肃省种植的切花百合上克隆了PlAMV cp基因的部分序列,连接表达载体pET-28a(+),转化Escherichia coli BL21(DE3)菌株,经IPTG诱导和Ni-NTA重力柱层析获得了大量纯化的CP融合蛋白,将其作为抗原免疫家兔制备了多克隆抗体。序列分析结果表明,PlAMV cp基因片段大小为621 bp,编码207个氨基酸;与已注册的PlAMV分离物相比,核苷酸序列相似性为74.7%~100%,氨基酸序列相似性达到83.6%~100%;不同植物PlAMV的分离物序列差异明显,病毒种群分布呈现寄主差异。SDS-PAGE结果表明,CP蛋白在E.coli BL21(DE3)中大量表达,蛋白相对分子质量为24 ku。Western blot结果显示,抗体能够特异结合天然PlAMV病毒蛋白,可用于检测感病材料中PlAMV蛋白的表达量。本研究可以为PlAMV的血清学检测技术开发和致病机理研究提供一定的参考。

百合车前草花叶病毒的脱毒组培技术

为百合种苗快速繁殖提供参考,以带有车前草花叶病毒的罗宾娜为材料,采用组培苗与栽培种球2种形式,通过茎尖培养与热处理+茎尖培养2种脱毒方式处理,以获得最佳组培苗的处理方式。结果表明:以MS+6-BA1.0毫克/升+NAA0.5毫克/升+2,4-D0.1毫克/升+蔗糖30克/升+琼脂7克/升+活性炭1克/升,酸碱度5.8为茎尖培养基,能获得百合脱毒的再生植株。

车前草花叶病毒对我国百合产业的风险评估

近年来,车前草花叶病毒(Plantago asiatica mosaic virus,Pl AMV)在世界范围内迅速扩散,具有较高的检疫风险,有必要开展相关研究。为此,采用有害生物风险分析程序,应用多指标综合评价方法,从国内外分布状况、潜在危险性、主要受害作物百合的经济重要性、传播扩散的可能性、风险管理难度等方面对该病毒入侵我国的风险进行了定性和定量分析,得出Pl AMV综合风险值R=2.25,入侵我国的风险性等级为高风险。鉴于Pl AMV随进口百合种球传入我国的风险日益增大,一旦传入和定殖扩散,根除困难,需加强对该有害生物的分析与管控,严防其传入。

进境荷兰百合中车前草花叶病毒的分子鉴定及序列分析

对一株进境隔离种植中疑似病毒症状的荷兰百合进行检测、鉴定。采用RT-PCR方法对疑似样品的部分基因序列进行扩增、测序,比对后,建立系统发育树进行亲缘关系分析。结果表明,采用香石竹潜隐病毒属和马铃薯X病毒属(CarlapCar1I/M4T和Potex 5/Potex 1RC)简并引物均可扩增到预期大小的片段(1 257 nts和737 nts)。序列分析显示,扩增片段与车前草花叶病毒(Plantago asiatica mosaic virus,Pl AMV)3'端序列(包含TGBp2、TGBp1、CP,3’-NTS)和部分依赖于RNA的RNA聚合酶基因序列一致性可达79.9%~99.5%和80.5%~99.3%。利用PlAMV的特异性引物(PlAMV-cpup/PlAMV-cpdw)进行检测,结果进一步证实该百合样品含有PlAMV。通过建立系统发育树得出,该病毒分离物与来自荷兰的PlAMV百合分离物优先聚为一簇,表明二者的亲缘关系最近。这是我国口岸首次截获车前草花叶病毒的报道。

辽宁局全国首次在进境荷兰百合中检出亚洲车前草花叶病毒

2015年10月,辽宁出入境检验检疫局大窑湾口岸将荷兰进境的百合种球送至国家级重点实验室北方隔离苗圃进行检疫,在隔离种植期间发现一染病植株,经实验室检测确定其为亚洲车前草花叶病毒（Plantago asiatica mosaic virus,Pl AMV）,这是我国口岸首次检出该种高风险性植物病毒。亚洲车前草花叶病毒是马铃薯X病毒属（Potexvirus）成员。1976年在前苏联车前草中首次报道,

百合中车前草花叶病毒的实时荧光定量PCR检测

车前草花叶病毒(Plantago asiatica mosaic virus,PlAMV)病是侵染百合等作物的危险性病害,亟待建立其监测防控体系,以防止其扩散传播。根据PlAMV的外壳蛋白(Coat protein,CP)基因的保守序列设计特异性检测引物,通过对引物浓度和反应退火温度进行优化,建立了以CP-2 F/R为特异引物,引物浓度为10μmol·L^(-1),退火温度为59.4℃的高效实时荧光定量PCR检测技术。该检测技术特异性强,灵敏度是RT-PCR的100倍,病毒最低检出浓度为13 copies·μL^(-1)。对75份田间百合样品进行检测,结果显示:RT-qPCR方法检测(29份,38.67%)高于RT-PCR检测出的阳性样品(21份,28.00%)。