表达人TCRα转基因小鼠1型糖尿病模型的建立及其免疫机制的初步研究

目的建立T细胞介导的1型糖尿病(type 1 diabetes mellitus,T1DM)动物模型,为进一步研究该病发病免疫机理奠定基础。方法将雌雄各10只系统表达人T细胞受体α基因(T cell receptor,TCRα)小鼠随机分为模型组和对照组,其中模型组小鼠腹腔注射链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)每次100 mg/(kg·bw),间隔1 d后再注射一次,对照组注射等量的生理盐水;注射后每周测定一次血糖和体重,当出现重度糖尿病临床表现时处死,其余小鼠注射后8周处死,观察胰腺组织病理学改变,并进行外周血淋巴细胞亚群,以及血清胰岛素和细胞因子的测定。结果模型组小鼠发病率为10/10,对照组为0/10;模型组外周血T细胞亚群CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+水平较对照组均有显著降低(P<0.01),B细胞表型CD19+水平与对照组差异无显著性(P>0.05);注射STZ后约8周,模型组血清胰岛素、IFN-γ、TNF-β较对照组差异有显著性(P<0.01),IL-2高于对照组但差异无显著性(P>0.05)。结论在系统表达人TCRα基因小鼠腹腔注射链脲佐菌素(STZ)后2～8周可建立稳定1型糖尿病的小鼠模型。

超声微泡造影剂对心肌组织的生物学效应及介导VEGF基因转染大鼠心肌的实验研究

目的 探讨超声微泡造影剂对心肌组织的生物学效应及其介导VEGF基因转染大鼠心肌的有效性。方法 18只健康雄性Wistar大鼠 ,取 3只采用超声波在鼠胸壁破坏微泡造影剂 ,观察对心肌组织显微结构的影响。将另 15只急性心肌梗死 3天后的雄性Wistar大鼠分为 3组 ,每组 5只。第一组采用超声破坏微泡造影剂的方式 ,将pcD2 VEGF12 1基因转染大鼠心肌至造影剂不再显影 (约 6min) ;第二组尾静脉输入同等剂量携pcD2 VEGF12 1基因的造影剂 ;第三组为对照。 2周后 ,取缺血心肌组织行VEGF免疫组织化学染色 ,观察心肌组织血管内皮生长因子 (VEGF)蛋白表达情况。结果 超声波破坏微泡造影剂能使心肌组织充血 ,产生大量空泡 ,并有部分心肌细胞坏死。采用超声微泡造影剂介导的VEGF基因转染 ,能明显增强大鼠心肌组织VEGF蛋白的表达。结论 超声微泡造影剂能明显增强对组织的空化效应 ,其介导的VEGF基因治疗是一种无创、新型、高效的基因转移方法。

腺病毒介导的rHSG-1基因转染对自发性高血压大鼠血管平滑肌细胞增殖的影响

目的 :应用腺病毒介导的转基因方式转染大鼠增殖抑制基因 (rHSG 1) ,以观察rHSG 1对自发性高血压大鼠 (SHR)主动脉血管平滑肌细胞 (VSMCs)增殖的影响。方法 :体外培养大鼠主动脉血管平滑肌细胞并转染含有rHSG 1基因的重组复制缺陷型腺病毒载体 (Ad5rHSG 1) ,采用细胞计数、MTT和3 H thymidine参入法 ,观察rHSG 1对细胞增殖的影响 ;采用流式细胞仪分析rHSG 1对细胞周期的影响 ;应用WesternBlot方法检测rHSG 1对细胞周期调控蛋白p2 7Kip1、p2 1Cip1和增殖细胞核抗原 (proliferatingcellnuclearangitin ,PCNA)的作用。结果 :Ad5rHSG 1转染培养的SHRVSMCs后 ,能明显抑制细胞增殖 ,与对照组相比抑制率为 4 0 % (P <0 .0 1) ;细胞周期阻滞于G0 /G1期 ,周期调控蛋白p2 7Kip1、p2 1Cip1表达升高 ,PCNA表达降低。结论 :rHSG 1基因过表达可以抑制培养的自发性高血压大鼠血管平滑肌细胞增殖 ,并可能是通过参与细胞周期调节发挥作用。

特异性TCRαβ基因转染T细胞促进抗肿瘤免疫的研究

目的:研究肝癌特异性TCR基因TCRVα12.2-Vβ7.1转染T细胞后,促进T细胞识别肿瘤抗原,活化抗肿瘤免疫反应的效果。方法:构建重组腺病毒Ad5F35-TRAV-TRBV,以之感染T细胞并优化最佳感染条件。钙黄绿素染色法检测T细胞对不同肿瘤靶细胞株的杀伤活性。Annexin V-PI双染法检测靶细胞凋亡比例。流式细胞术检测T细胞表面FasL表达比例。ELISA法检测T细胞作用于靶细胞后IFN-γ与IL-2分泌水平。结果:成功将TCRVα12.2-Vβ7.1基因片段构建入嵌合型腺病毒载体,获得重组腺病毒Ad5F35-TRAV-TRBV。感染复数为100时,重组腺病毒有最高转染效率。感染3天后,TCRVα12Vβ7阳性细胞比例超过25%。特异性TCR基因转染有效促进T细胞杀伤AFP阳性肝癌细胞,特异性裂解率显著提高(P<0.001)。特异性TCR基因转染有效促进T细胞诱导靶细胞凋亡(P<0.001)。同时,T细胞表面FasL表达比例上升(P<0.001)。TCR基因转染T细胞作用于AFP抗原阳性靶细胞后IFN-γ分泌显著提高(P<0.001)。结论:重组腺病毒Ad5F35-TRAV-TRBV成功介导肿瘤特异性TCR基因转染T细胞。TCR基因转染可有效促进T细胞识别抗原阳性肿瘤细胞,并发挥抗肿瘤免疫效应。

体内精原干细胞转染法建立转基因小鼠

将人Bcl-2 cDNA与小鼠乳清酸蛋白(WAP)5’上游调控序列融合后,与脂质体按一定比例混合,再加入适量的台盼蓝制成转染液,注入到小鼠睾丸中的曲细精管中,转染精原干细胞以探讨建立转基因小鼠的可行性。共注射了3只公鼠,4天后将公鼠与发情母鼠合笼交配,共生仔鼠20只。检测结果表明,有3只呈PCR阳性,Southern blot检测,阳性鼠2只,1只公鼠,1只母鼠,其中,公鼠意外死亡;Western blot证实,1只母鼠的乳腺组织表达了Bcl-2蛋白,其F1代的16只小鼠中,有7只呈PCR阳性。证实了体内精原干细胞转染建立转基因动物的可行性。

FasL基因转染诱导大鼠肾移植免疫耐受的实验研究

目的:探讨Fas配体(Fasligand,FasL)在大鼠肾移植免疫耐受中的作用及意义。方法:首先建立大鼠同种肾移植模型。实验组供肾移植前用1ml含重组腺病毒Ad-FasL的肾脏冷保存液经肾动脉灌注;建立同种大鼠肾移植模型。分别观察电镜、免疫组织化学法、肾功能测定、生存期,比较各组间的不同。结果:Ad-FasL治疗组肾移植受体大鼠平均存活天数为31.3d,与对照组的平均9.1d存活时间比较,平均存活天数增加了22d,差异显著。Ad-FasL治疗组的移植肾功能基本保持稳定,对照组在术后5d切除对侧肾脏后血清肌酐浓度迅速上升。结论:腺病毒载体可成功介导FasL基因对大鼠肾脏的转染,并对移植肾起免疫保护作用、延长移植肾的存活时间。

红景天对阿尔茨海默病APP-C100转基因小鼠的影响

目的 探讨红景天对 AD转基因小鼠行为的影响和抗氧化应激反应的神经保护作用。方法 用 APP- C1 0 0转基因小鼠和健康(NTg)鼠模型来观察单剂红景天 8w抗氧化效果。Open field活动用来评估转基因鼠和健康鼠的移动、探索能力及焦虑状态。 Western印迹法定量分析转基因鼠血清及大脑 Cn/ Zn SOD1、APP及 Aβ蛋白含量。免疫组织化学法观察转基因鼠大脑皮层和海马的病理改变。结果 与 NTg鼠比较 ,转基因鼠通过格子次数 (grid cross)和排泄物 (粪尿 )均显著增加 (P<0 .0 5)。通过 Western印迹法及密度定量测定 ,红景天治疗组的转基因鼠 Cn/ ZnSOD1蛋白含量在血清及大脑中较对照组明显减少 (P<0 .0 5)。大脑 APP、βCTF及 Aβ蛋白含量无变化 ,免疫组化在大脑皮层和海马未见 Aβ沉积。结论 红景天可通过减少 SOD1氧化蛋白的含量 。

转内皮抑制素基因治疗大鼠角膜新生血管

目的:探讨转染内皮抑制素(Endostatin)基因对酸烧伤引起的大鼠角膜新生血管的基因治疗。方法:通过限制性内切酶酶切反应、聚合酶链式反应、DNA测序及用NCBIBLAST软件与基因库序列比较的方法进行鉴定,鉴定后在大肠杆菌中扩增,用质粒纯化试剂盒抽提纯化;用750g/L硝酸银和250g/L硝酸钾混合烧灼液制作大鼠角膜新生血管模型,用结膜下注射脂质体包裹的质粒pBlast- hEndostatin来进行体内基因治疗。结果:实验证实质粒pBlast-hEndostatin含有人endostatin基因。结膜下注射脂质体包裹的质粒Tel押029-82245172Email押IJO.2000@163.compBlast-hEndostatin对酸烧伤引起的炎症性角膜新生血管有明显抑制作用,术后6,10,15d对角膜新生血管面积的抑制率分别为37%,40%,43%;对角膜新生血管密度也有明显的抑制作用,抑制率达40%。对角膜新生血管长度和角膜炎症细胞没有明显抑制作用。角膜新生血管面积与角膜水肿、角膜混浊呈正相关。结论:用结膜下注射脂质体包裹的内皮抑制素基因可以部分抑制酸烧伤引起的大鼠角膜新生血管。其作用机制是转基因产生的内皮抑制素蛋白直接抑制角膜新生血管的形成,而不是通过抑制炎症反应来抑制角膜新生血管的形成。

DCN基因转染对大鼠肾系膜细胞生长及表型改变的影响

目的 通过观察转染DCN基因的大鼠系膜细胞 (MsC)生长及其一些表型的改变 ,为其用作细胞载体回输入大鼠肾病模型体内进行基因治疗奠定实验基础。方法 采用MTT比色法和流式细胞仪技术 ,检测该MsC株生长情况 ;Northernblot和Westernblot法检测其TGF β1mRNA、ColⅣmRNA和TGF β1蛋白表达水平 ;半定量RT PCR法检测其TIMP 2mRNA表达的改变。结果 与未转染MsC相比 ,转染DCN基因的MsC株的生长受到明显抑制 (5d时P <0 .0 5 ,6d时P <0 .0 1) ;G0 /G1期比例增加 ,S期比例降低 ,提示其生长缓慢 ;TGF β1和ColⅣmRNA表达明显降低 ,TGF β1蛋白分泌减少 ;TIMP 2mRNA表达明显下调。 结论 转染DCN基因的MsC可被用作载体开展对大鼠系膜增生性肾炎的实验治疗。

实时定量PCR检测GDNF基因转染大鼠BMSCs后的转录水平

目的了解外源性胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)基因在大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)中的转录水平。方法体外分离培养大鼠BMSCs,将其随机分为GDNF基因转染组、空质粒转染组和未转染组3组;GDNF基因转染组和空质粒转染组分别用GDNF基因和空质粒重组腺病毒感染BMSCs,并按感染后培养时间的不同(3、6、9和12天)又分为4个亚组。采用实时定量PCR技术检测GDNF基因在BMSCs中的转录水平。结果空质粒转染组和未转染组无GDNFmRNA的表达,GDNF基因转染组在转染后3～12天的GDNFmRNA相对表达量为0.00751±0.00067。结论腺病毒介导的基因转染技术将GDNF基因转染至骨髓间充质干细胞中,有外源性基因GDNFmRNA的表达,这为进一步研究以GDNF基因转染的BMSCs治疗中枢神经系统疾病奠定了基础。

转染人血红素加氧酶-1基因对大鼠血管平滑肌细胞抗氧化损伤的作用

本实验构建含人血红素加氧酶 1(hHO 1)基因的逆转录病毒载体XM 6/hHO 1,将其导入离体培养的大鼠血管平滑肌细胞 (vascularsmoothmusclecells,VSMC) ,观察外源性hHO 1基因在VSMC内的表达及其抗活性氧损伤作用。结果表明 :( 1)hHO 1基因可在靶细胞中明显表达 ,转染VSMC的HO 1蛋白表达和HO酶活性分别比非转染细胞高 1 8倍和 2 0倍 ;( 2 )转染hHO 1的VSMC可对抗大剂量H2 O2 对细胞的损伤作用 ,表现为细胞存活率增加和乳酸脱氢酶 (LDH)漏出减少 ,上述保护作用可被HO特异性抑制剂锌原卟啉IX (Zinc protoporphyrinIX ,ZnPP IX)所阻断。研究结果提示 ,外源性HO

大鼠颈动脉球囊损伤局部A20基因转染后内皮细胞再生及血管超微结构的影响

目的：锌脂蛋白A20是核因子κB信号系统活化的产物。研究证实核因子κB的激活是球囊损伤动脉后血管狭窄发生的重要机制之一。实验拟观察锌指蛋白A20对大鼠颈总动脉球囊损伤局部血管内皮再生和血管超微结构的影响。方法：实验于2006-03／2007-06在大连医科大学附属第二医院中心实验室完成。①实验材料：健康雄性SD大鼠42只，体质量350-400g。②分组及实验过程：采用随机数字表法将大鼠分为3组，每组14只。制备A20质粒DNA，建立大鼠颈总动脉球囊损伤模型（假手术组只进行颈动脉结扎，不进行球囊损伤术）；对照组：球囊损伤术后局部灌注Lipofectamine 2000 Reagent＋TE缓冲液；治疗组：球囊损伤术后局部灌注Lipofectamine 2000 Reagent＋TE缓冲液＋pCAGGS-GFP／A20重组质粒。A20质粒DNA在球囊损伤大鼠颈动脉的局部转染。③实验评估：荧光显微镜观察A20在损伤动脉壁的转染效率；伊文思蓝染色法评估损伤后颈动脉内皮再生情况；透射电镜观察血管超微结构改变。实验过程对动物的处理符合动物论理学标准。结果：①球囊损伤术和A20转染治疗后2周，治疗组再内皮化百分比大于对照组（P〈0．05）。②假手术组大鼠颈动脉平滑肌细胞电镜下呈典型的“收缩表型”；对照组球囊损伤后3d可见合成型细胞及过渡型细胞，7d血管平滑肌细胞表型发生明显改变，呈典型的“合成表型”，治疗组术后7d可见接近收缩型的血管平滑肌细胞。结论：局部转染A20基因可促进损伤血管内皮再生，抑制损伤处血管平滑肌细胞表型转化。

TGF-β1基因转染大鼠脂肪干细胞向软骨细胞分化的实验研究

目的TGF-β1基因转染大鼠的ADSCs(adipose stromal cells,ADSCs),诱导其向软骨细胞分化,为软骨组织工程学种子细胞提供新方法。方法分离、培养大鼠的ADSCs,免疫荧光法进行鉴定;TGF-β1基因转染ADSCs,对转染后细胞进行筛选;MTT法测定筛选后细胞的增殖活性;RT-PCR、Western blot对筛选后细胞的表达进行检测。结果成功分离、培养大鼠的ADSCs;细胞表面标志物CD29和CD44表达阳性,CD106和CD34表达阴性;基因转染后细胞的增殖力变强;转染TGF-β1的ADSCs在目的基因TGF-β1、SOX9、Aggrecan、Collagen II mRNA的表达和软骨特异性基质-Collagen II的分泌增强,明显高于对照组和转染空载体组;结果TGF-β1基因转染后ADSCs具有了软骨细胞的表型特征,可以用作软骨组织工程的种子细胞。

TGFβ1对转染Smad4/Smad7基因的大鼠系膜细胞Ⅰ、Ⅳ型胶原表达的影响

目的 探讨Smad4 /Smad7信号蛋白在转化生长因子β1(TGFβ1)作用下对大鼠系膜细胞 (MsC)Ⅰ、Ⅳ型胶原表达的影响。方法 经脂质体介导分别将Smad4 /Smad7基因瞬时转染体外培养的大鼠MsC ,并用免疫荧光、RT PCR和Westernblot法检测其转染成功与否 ;再用Westernblot法分别观察转基因MsC及其在TGFβ1作用下 ,其Ⅰ、Ⅳ型胶原蛋白表达的改变。结果 与转染空载体的MsC相比较 ,转染Smad4基因的MsC ,其Ⅰ、Ⅳ型胶原蛋白表达分别增强 1.2和 1.8倍 ,经TGFβ1作用后升高 1.8和 3.3倍 (P <0 .0 1) ;而转染Smad7基因的MsC ,其Ⅰ、Ⅳ型胶原蛋白表达分别下降 1.4和 1.9倍 ,经TGFβ1作用后则降低 1.7和 2 .4倍 (P <0 .0 1)。 结论 TGFβ1/Smad信号通路可从正反两方面调节MsCⅠ。

大鼠肾脏系膜细胞转染人TGF-β1基因可增强MMP-2表达

目的 研究转化生长因子β１（ＴＧＦβ１）对培养的大鼠肾小球系膜细胞（ＭｓＣ）基质金属蛋白酶２（ＭＭＰ２）表达的影响。方法 采用Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ将人ＴＧＦβ１基因转染培养的大鼠ＭｓＣ，经Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ鉴定其转染成功否；又分别应用Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ．Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ．酶谱分析法检测阳性表达人ＴＧＦβ１的ＭｓＣＭＭＰ２ｍＲＮＡ、蛋白及酶活性变化。结果 成功获得稳定过表达人ＴＧＦβ１的大鼠ＭｓＣ克隆（ＭＴＧ１），该细胞克隆的ＭＭＰ２ｍＲＮＡ．蛋白表达及其酶活性均获增强。结论 ＴＧＦβ１可增强ＭｓＣＭＭＰ２ｍＲＮＡ、蛋白表达，并提高其酶活性，这为进一步阐明ＴＧＦβ１在肾小球硬化发生机制中的作用提供了重要的实验手段和依据。

大鼠β-防御素-2基因气道转染增强肺抗感染防御功能的研究

β-防御素体外试验显示具广谱抗菌活性 ,本研究应用转基因方法评估其体内抗菌作用。构建大鼠 β-防御素 - 2 (r BD2 )重组质粒 p BK- CMV- r BD2和 p CDNA- 3.1- Myc- His(+) - r BD2 ,通过脂质体包裹的方法将重组质粒经气管滴入 ,检测其在气管和肺组织表达情况 ,并应用肺组织匀浆上清菌落计数法检察对绿脓杆菌的肺清除率。结果显示在基因转染大鼠的气管和肺组织内均检测到 r BD2 - His融合蛋白基因 m RNA和蛋白的表达 ,说明脂质体包裹的重组 β-防御素 - 2 p BK- CMV- r BD2质粒可有效转染气道上皮组织。肺细菌清除率实验显示构建重组质粒 p BK-CMV- r BD2气道转染与对照相比可显著提高肺组织对绿脓杆菌的清除率 (n(8,p(0 .0 1)。本研究表明 β-防御素基因气道转染可提高呼吸道天然抗感染防御功能 ,可能在呼吸道感染的防治实践中具有潜在应用价值。

转染人TGF-β1基因对大鼠系膜细胞基质表达的影响

目的 通过对大鼠系膜细胞(MsC)转染人TGF-β1基因,观察该基因对MsC表达细胞外基质成分的影响。方法 采用脂质体介导法转染人TGF-β1基因至大鼠MsC,Western blot法鉴定;细胞爬片ABC免疫酶标法观察纤维连接蛋白(FN)、Ⅳ型胶原、Ⅰ型胶原、层黏蛋白(LM)的表达,并对结果定量分析。结果 重组质粒pcDNA 3.0-TGF-β1成功转染至大鼠MsC,Western blot及免疫组化检测均证实TGF-β1蛋白表达增强;与正常的MsC相比,TGF-β1转染的MsC表达FN、Ⅳ型胶原增强,其差异有显著性意义;而Ⅰ型胶原、LM表达改变不明显。结论 TGF-β1可通过对大鼠MsC ECM成分表达的影响,而在肾小球硬化的发生发展过程起着重要作用。

pLNCX-SOD基因转染大鼠心肌细胞联合黄芪对胆汁毒性损害的保护作用

目的 :探讨pLNCX -SOD基因转染大鼠心肌细胞联合中药黄芪对胆汁毒性损害的保护作用及中药黄芪的作用机制。 方法 :原代培养大鼠心肌细胞 ,阳离子介导心肌细胞转染 ,PCR法、Western -blot印迹分析检测SOD基因转染、基因表达 ,MTT比色法检测pLNCX -SOD基因转染联合中药黄芪对心肌细胞损害的保护。 结果 :转染后的心肌细胞瞬时表达SOD ,增强了对胆汁毒性的耐受 ,半数致死浓度 (IC 5 0 )由原来的 (1 4 7± 0 13) %提高了 2 19倍 ,达 (3 2 1± 0 17) %。联合黄芪后 ,半数致死浓度由单纯转染的 (3 2 1± 0 17) %提高到 (6 4 9± 0 38) % ,P <0 0 1。 结论 :pLNCX -SOD基因转染心肌细胞对胆汁毒性损害的保护作用 ,联合中药黄芪对胆汁毒性的损害具有协同保护作用。

利用转基因小鼠及转染色体小鼠产生人抗体的研究进展

自单克隆抗体（ｍＡｂ）技术问世以来，解决了生命科学的许多重要问题，但其鼠源性导致的ＨＡＭＡ反应大大限制了它在人体治疗中的应用。因此，制备人抗体成了亟待解决的难题。转入Ｉｇ基因组小鼠与转染色体小鼠的构建成功则为解决这一难题提供了可行途径。本文就这两系小鼠的构建及其在制备人抗体中的应用进展作一综述。

IL-18基因转染对大鼠C6胶质瘤细胞生长特性的影响

探讨IL-18基因转染对大鼠C6胶质瘤细胞生长特性的影响。用MTT法和流式细胞术检测C6/IL-18细胞和C6细胞的增殖特性和细胞周期分布。免疫细胞化学检测C6/IL-18细胞和C6细胞的增殖细胞核抗原(PCNA)、波形蛋白表达。结果显示,与C6细胞相比C6/IL-18细胞的增殖能力降低,G0/G1期细胞增多而G2/M期细胞减少;PCNA、波形蛋白表达降低。研究表明,IL-18基因具有抑制C6胶质瘤细胞增殖、降低其恶性程度的作用。