西瓜枯萎病菌T-DNA插入转化子库的构建及其质量评价

为研究西瓜枯萎病菌的致病分子机理,开展了病原菌的转化子库构建工作。采用携带潮霉素抗性p TFCM双元载体的农杆菌AGL-1介导的ATMT转化方法 ,获得菌株FON-01的转化子,通过表型观察筛选突变体。结果表明:当乙酰丁香酮(AS)浓度为200μmol/L、农杆菌OD600为0.4、分生孢子浓度为1×106个/m L时,于28℃共培养48 h转化效率高达(663.33±24.95)个/106个孢子。构建了总数为3 832个的转化子库并对其进行了质量评价,从2 201个转化子中筛选出菌落形态、生长速度及产孢量等方面有所变异的突变体73个。病原菌转化子库的构建为进一步开展致病分子机理及相关基因克隆等方面研究奠定基础。

木薯细菌性枯萎病菌转座子库的构建及其质量评价

为了研究木薯细菌性枯萎病菌的致病分子机理,本研究开展了病原菌的转化子库构建工作。采用电击法,将EZ::TN转座体转化野生型菌株。获得了总数为20 382个转化子并进行了质量评价,采用剪叶法从9 872个转化子中筛选出94个致病性变异的转化子。采用Tail-PCR获得了致病力丧失突变体Xtn62-36的侧翼序列,分析结果表明可能是外源片段插入预测基因AspCXam的编码区而造成致病力丧失。病原菌转化子库的构建及Tail-PCR技术的应用为进一步开展致病相关基因功能的研究提供了基础。

甘蓝枯萎病菌REMI转化体系的建立

建立高效、稳定的甘蓝枯萎病菌REMI转化体系,为进一步获得特定表型突变体及基因功能研究建立技术储备。利用REMI(restriction enzyme mediate intergration)转化方法,将线性化的含有潮霉素抗性基因的pUCAT-PH质粒转化甘蓝枯萎病菌A6菌株的原生质体,摸索获得转化子最适的潮霉素筛选浓度以及不同限制性内切酶和酶量对转化效率的影响;利用PCR(polymerase chain reaction)技术对潮霉素抗性转化子进行验证。结果表明转化子的最适潮霉素筛选浓度为50μg/mL;转化效率较高的限制性内切酶为HindⅢ,并且转化效率最高时的酶量为20U。利用该转化体系构建了含1 050个转化子的甘蓝枯萎病菌转化子库,对转化子进行Southern验证,证明该转化体系是可行的。