日本七鳃鳗转化生长因子βⅠ型受体基因(L-Tgfbr1)的克隆与表达分析

作为无颌类脊椎动物的现存代表之一,日本七鳃鳗(Lampetrajaponica)是研究免疫系统起源与进化的重要模型。为了探究TGF-β(Transforming growth factor beta)信号通路在日本七鳃鳗免疫调节中的功能,本研究利用PCR技术克隆了日本七鳃鳗TGF-βⅠ型受体基因(L-Tgfbr1)的编码序列,开放阅读框长度为1335 bp,编码444个氨基酸残基。L-Tgfbr1蛋白含有已知的TGF-βⅠ型受体分子的主要功能结构域,其中位于胞内的丝/苏氨酸激酶催化结构域保守性较高。系统进化树分析表明,L-Tgfbr1处于脊椎动物Tgfbr1蛋白的底端进化枝上,表明其在Tgfbr1进化史中具有原始性地位。实时定量PCR结果发现,L-Tgfbr1在心脏等组织中的转录水平较高。利用脂多糖注入七鳃鳗激活其先天性免疫应答,L-Tgfbr1在肾脏、鳃、髓小体、肝脏、白细胞、口腔腺中的转录水平呈现一过性的迅速上调。利用免疫印迹进一步验证了脂多糖免疫24 h时后L-Tgfbr1在白细胞中的蛋白表达水平显著上调。利用免疫荧光染色发现L-Tgfbr1蛋白主要分布于七鳃鳗白细胞和髓小体细胞的细胞质中。以上结果表明L-Tgfbr1及其介导的TGF-β通路可能在七鳃鳗免疫调控中发挥重要功能。

盆炎通络方对输卵管炎性阻塞性不孕症模型大鼠转化生长因子-β1、Ⅱ型转化生长因子-β受体和Smad3表达的影响

目的:研究盆炎通络方对输卵管炎性阻塞性不孕症(Salpingitis Obstructive Infertility,SOI)模型大鼠转化生长因子-β1(Transforming Growth Factor-β1,TGF-β1)、Ⅱ型TGF-β受体(TGF-βTypeⅡReceptor,TβRⅡ)和Smad3表达的影响,并探讨其作用机制。方法:采用双侧输卵管注射苯酚糊剂法制备SOI大鼠模型。造模成功后随机分为假手术组、模型组、康妇炎胶囊组、盆炎通络方低剂量组、盆炎通络方中剂量组、盆炎通络方高剂量组共6组。灌胃治疗30 d后,观察输卵管外观形态,并收集输卵管组织,采用苏木精-伊红染色法观察病理情况,免疫组化法检测输卵管组织中TGF-β1、TβRⅡ和Smad3表达。结果:肉眼观察,与模型组对比,各治疗组输卵管组织充血、肿胀现象均有不同程度的改善,以盆炎通络方高剂量组最为明显。光镜下,各治疗组均不程度地减轻了大鼠输卵管组织炎性反应、改善了输卵管组织纤维化。与假手术组对比,模型组输卵管组织中TGF-β1、TβRⅡ和Smad3表达量明显增加(P<0.01)。与模型组对比,各治疗组输卵组织中TGF-β1、TβRⅡ和Smad3表达量均减少(P<0.05,P<0.01)。结论:盆炎通络方是治疗SOI的有效方剂,其可能的机制是下调输卵管组织中TGF-β1及TβRⅡ和Smad3表达,减轻炎症反应、抑制输卵管组织纤维化,从而改善输卵管组织结构。

转化生长因子β及其受体Ⅰ、Ⅱ在银屑病皮损中的表达

目的 探讨转化生长因子 β(TGF β)及其受体Ⅰ、Ⅱ在银屑病角质形成细胞中的表达及其与银屑病的关系。方法 采用免疫组化方法检测TGF β1,TGF β2 ,TGF βRI,TGF βRⅡ在银屑病皮损、皮损周边正常皮肤及正常对照皮肤的原位表达。结果 与正常皮肤相比 ,TGF β1、TGF β2 、TGF βRⅠ和TGF βRⅡ在银屑病表皮基底层表达明显减弱或缺失 ;TGF βRⅡ在棘层至颗粒层的阳性表达率增加。结论 TGF β/TGF βR在银屑病皮损基底层的表达下调或缺乏 ,可能在银屑病角质形成细胞过度增殖中发挥作用 ,而且TGF β/TGF

转化生长因子β_1及其Ⅰ型和Ⅱ型受体在子宫内膜腺癌中的表达及意义

目的探讨转化生长因子β1(TGF-β1)及其Ⅰ型受体(TβRⅠ)、Ⅱ型受体(TβRⅡ)在子宫内膜腺癌组织中的表达情况及临床意义。方法采用免疫组织化学的方法检测48例子宫内膜腺癌、19例子宫内膜非典型增生、20例正常增殖期子宫内膜组织中TGF-β1、TβRⅠ、TβRⅡ蛋白的表达情况,并结合临床资料进行分析。结果 TGF-β1、TβRⅠ在子宫内膜腺癌、子宫内膜非典型增生中的表达明显低于正常增殖期子宫内膜(P<0.01),TβRⅡ在子宫内膜腺癌、子宫内膜非典型增生及正常增殖期子宫内膜之间的表达差异无统计学意义(P>0.05)。TGF-β1、TβRⅠ、TβRⅡ在中、低分化癌组织中的表达明显低于高分化癌组织(P<0.05,P<0.01),但三者的表达与临床分期、肌层浸润、淋巴结转移无明显关系(P>0.05)。正常增殖期子宫内膜、子宫内膜非典型增生组织中TGF-β1、TβRⅠ、TβRⅡ三者之间表达呈一致性,两两均呈正相关,但子宫内膜腺癌组织中TβRⅠ、TβRⅡ的表达缺乏相关性。结论 TGF-β1、TβRⅠ、TβRⅡ表达的异常共同参与了子宫内膜腺癌的发生和发展,但TβRⅠ表达的下调可能是始动因素,起着更关键的作用。

瘢痕疙瘩成纤维细胞中转化生长因子-βⅠ、Ⅱ型受体的表达及调控

目的 :了解瘢痕疙瘩成纤维细胞中转化生长因子 (Transforminggrowthfactor ,TGF) βⅠ、Ⅱ型受体的表达及TGF β1 、β3对其的影响。方法 :体外培养瘢痕疙瘩成纤维细胞 (KFB)和正常皮肤成纤维细胞 (NFB) ,利用免疫组化及计算机图象分析系统测定TGF βⅠ、Ⅱ型受体含量。 结果 :KFB胞浆内阳性信号明显强于NFB (P <0 0 5 ) ;经TGF β1 、β3处理组胞浆内阳性信号差别均不明显 (P >0 0 5 )。结论 :KFB存在高表达的TGF βⅠ、Ⅱ型受体 ;TGF β1 、β3均能促进KFBTGF βⅠ。

转化生长因子β_1及其Ⅰ、Ⅱ型受体与凝血纤溶因子的相关研究及其促使肾小球硬化的机制探讨

目的 探讨TGF β1 (transforminggrowthfactorβ1 、TGF β1 )、TGF βRⅠ、Ⅱ (TGF βRTypeⅠ ,Ⅱreceptor,TGF βRⅠ、Ⅱ )在人类各种肾小球疾病中的作用及与凝血纤溶因子 (FRA、FN、α2 PI、PLG)之间的相互关系及其促使肾小球硬化的作用机理 ,从而寻找影响肾小球疾病发生发展的主要因素。方法 采用免疫组化SABC法检测系膜增生性肾炎 (MsPGN)、系膜毛细血管性肾炎(MPGN)、局灶节段性肾小球硬化 (FGS)、膜性肾病 (MN)共 4 1例中TGF β1 、TGF βRⅠ、Ⅱ的表达 ;直接免疫荧光法检测FN和FRA ;间接免疫荧光法检测α2 PI和PLG ;共 6 5例。全部数据采用Ridit分析、Spearman’s等级相关。结果 (1 )TGF β1 、TGF βRⅠ、Ⅱ与FRA、FN、α2 PI、PLG之间存在显著正相关 ,随肾组织炎症程度及纤维化程度加重 ,其表达增强。 (2 )肾小球纤维化是多因素共同作用的结果。其中TGF β1 、TGF βRⅠ、Ⅱ与FRA、FN起着非常重要的主因素作用。 结论 TGF β1 、TGF βRⅠ、Ⅱ与FRA、FN、α2 PⅠ、PLG在肾组织内的共同表达及协同作用 。

转化生长因子β受体Ⅰ、Ⅱ和Smad 4在胃癌中的表达及其临床意义

目的胃癌是世界上最为常见的恶性肿瘤之一,预后较差,是人类主要的肿瘤致死病因。本研究旨在探讨转化生长因子β受体Ⅰ、Ⅱ(TβRⅠ、Ⅱ)和Smad 4 mRNA与胃癌发生、发展的关系。方法采用免疫组织化学和分子原位杂交的方法对67例胃癌、24例正常胃粘膜的TGFβ1蛋白和Smad 4 mRNA表达进行检测。结果胃癌组织中TβRⅠ、Ⅱ蛋白和Smad 4 mRNA表达率(分别为73.13%、49.25%和44.78%)较正常黏膜(均为95.83%)相比,均明显减弱(P<0.05)。TβRⅠ蛋白的表达与胃癌的临床病理因素无关(P>0.05),TβRⅡ蛋白和Smad 4 mRNA在胃癌中表达的变化与胃癌的临床病理因素有关(P<0.05)。TβRⅡ蛋白和Smad 4 mRNA在胃癌中表达的变化呈明显的负相关(P<0.05)。结论TβRⅡ蛋白和Smad 4 mRNA的低表达对细胞的恶性转化及增殖有一定的生物学意义。

转化生长因子β_1及其Ⅰ、Ⅱ型受体在人类肾小球疾病中的表达及促使肾组织硬化的机理

目的探讨转化生长因子β1(TGF-β1)及其Ⅰ、Ⅱ型受体(TGF-βRⅠ、Ⅱ)在人类肾小球疾病中的肾内表达位点及其与各肾小球疾病的关系。方法采用免疫组化SABC法检测系膜增生性肾炎(MsPGN)22例,系膜毛细血管性肾炎(MPGN)6例,局灶节段性肾小球硬化(FGS)9例,膜性肾病(MN)4例中TGF-β1、TGF-βRⅠ、Ⅱ的表达。结果TGF-β1、TGF-βRⅠ、Ⅱ在各肾小球疾病中均有不同程度的阳性表达。各组中MPGN表达均呈强阳性,差异显著(P<0.05);各组球-管染色强度存在显著差异(P<0.05)。结论TGF-β1、TGF-βRⅠ、Ⅱ的过度表达参与肾小球疾病的进展;其在肾小球、小管及间质细胞均有表达位点,但在肾小管-间质表达呈强阳性,而肾小球呈弱表达。

转化生长因子β_1及其Ⅰ、Ⅱ型受体在乳腺癌中的表达及意义

目的 探讨乳腺癌组织中转化生长因子 β1及其Ⅰ、Ⅱ型受体的表达及意义。方法 采用免疫组化LDP法对 6 2例乳腺癌 ,15例正常乳腺组织 ,2 6例乳腺增生症及 33例乳腺良性肿瘤进行TGFβ1、TβR Ⅰ和TβR \|Ⅱ检测。 结果 乳腺癌中TGFβ1阳性率高于其他 3组 ,TβR Ⅰ及TβR Ⅱ在乳腺癌中阳性率较正常乳腺组织阳性率低 ;TGFβ1、TβR Ⅰ及TβR Ⅱ的表达与乳腺癌患者的年龄、肿瘤大小及组织学分型无关 ,而与有无淋巴结转移及术后 5年生存率有关 ;TGFβ1高表达及TβR Ⅰ、TβR Ⅱ阴性乳腺癌患者预后差。结论 检测TGFβ1、TβR Ⅰ及TβR Ⅱ的表达对认识乳腺癌的进展、转移趋势及预后有参考价值。

转化生长因子β1Ⅱ型受体在大鼠慢性胰腺炎中的表达及氧化苦参碱对其的影响

目的:探讨转化生长因子β1Ⅱ型受体(TβRⅡ)在慢性胰腺炎(CP)纤维化病理进程中的作用,研究氧化苦参碱(OM)对胰腺纤维化的作用机制.方法:40只Wistar♂大鼠随机分为4组,即阴性对照组(NC组,n=10),CP模型组(CP组,n=10),OM干预组(OP组,n=10)和OM治疗组(OT组,n=10).NC组隔日给予腹腔注射生理盐水300mg/kg;其他每组均隔日腹腔注射二乙基硫代氨基甲酸盐(DDC)700mg/kg,30d停止.另外OP组于注射DDC同日开始每日腹腔注射OM100mg/kg,OT组于注射DDC1wk后开始每日腹腔注射OM100mg/kg,分别于注射DDC20d、40d后处死动物.胰腺组织行HE染色和Masson胶原染色并进行病理学评分,Western blot检测胰腺组织TβRⅡ的表达.结果:Masson染色测定结果显示,在20d、40d时CP组胶原纤维含量显著高于其余各组(20d:22.54%±4.45%vs13.16%±1.84%,19.58%±2.78%,2.45±0.24%;40d:35.14%±3.27%vs25.14%±3.67%,28.68%±2.55%,3.0%±0.32%;均P<0.05),OP组和OT组在40d时的胶原纤维面积百分比均比同组20d时增高(25.14%±3.67%vs13.16%±1.84%;28.68%±2.55%vs19.58%±2.78%;均P<0.05).West-ern blot结果显示,在20d、40d时,CP组胰腺组织TβRⅡ表达显著高于其余各组(20d:0.74±0.05vs0.47±0.03,0.61±0.03,0.21±0.02;40d:1.01±0.14vs0.64±0.08,0.75±0.04,0.23±0.03;均P<0.05),OP组和OT组在40d时胰腺组织TβRⅡ的表达均比20d时明显增高(0.64±0.08vs0.47±0.03;0.75±0.04vs0.61±0.03;均P<0.05).结论:腹腔注射DDC建立大鼠胰腺纤维化模型,方法有效.OM有显著的抗胰腺纤维化作用,可能与其降低TβRⅡ含量,抑制TGF-β信号转导通路有关.

转化生长因子β受体Ⅱ在大鼠实验性隐睾中的表达及与生精细胞凋亡的关系

目的:探讨转化生长因子β受体Ⅱ(TGFβ-RⅡ)与实验性隐睾诱导的生精细胞凋亡的关系。方法:建立大鼠单侧隐睾动物模型,SABC法检测TGFβ-RⅡ在隐睾及对照侧睾丸组织内的分布及表达,TUNEL法检测凋亡生精细胞。结果:术后不同时间组隐睾侧曲细精管TGFβ-RⅡ表达均低于对照侧(P<0.01)。术后隐睾侧细胞凋亡数量较对照侧明显增加(P<0.01)。结论:TGFβ可能通过TGFβ-RⅡ介导的信号转导过程在睾丸生精细胞凋亡过程中发挥重要的调控作用。

转化生长因子-β受体Ⅱ在增生性玻璃体视网膜病变增生膜中的表达

目的:观察及评估转化生长因子-β受体Ⅱ(TGF-βRⅡ)在增生性玻璃体视网膜病变(PVR)增生膜中的表达及临床意义。 方法:采用免疫组化和原位杂交方法,对13例PVR患者行玻璃体手术增生膜获得的16例进行TGF-βRⅡ的蛋白和mRNA的检测。 结果:免疫组化结果为:9例C2～C3级膜中,染色反应为阳性的有8例,总阳性率为88.9％。7例D1～D3级膜中有6例为阳性,总阳性率为85.7％。阳性细胞多是一类胞体为长圆形,胞核呈圆形或卵圆形的上皮样细胞。统计学分析TGF-βRⅡ标记与膜分级间无相关性(P>0.05)。原位杂交结果与免疫组化基本一致。 结论:PVR发生过程中视网膜色素上皮细胞在生长因子等的刺激下,TGF-βRⅡ表达显著上调,表明了TGF-β参与PVR增生膜的形成。眼科学报 2003;19:244-247。

洛沙坦对糖尿病大鼠肾脏转化生长因子-β_1及其Ⅱ型受体表达的影响及机制

目的 探讨血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)受体拮抗剂洛沙坦对糖尿病 (DM )大鼠肾脏的保护作用及其作用机制。 方法 大鼠随机分为正常对照组 (C组 )、糖尿病组 (DM组 )和DM洛沙坦治疗组 (DL组 ) ,每组 10只。观察 8周后用半定量RT PCR检测各组肾皮质转化生长因子 βⅡ型受体 (TβRⅡ)和纤维连接蛋白 (FN)mRNA的表达。用免疫组化检测各组肾皮质转化生长因子 β1(TGF β1)、TβRⅡ和FNmRNA的表达。检测血糖 (BG )、尿素氮 (BUN )、肌酐 (Cr)、血胰岛素 (Ins)、AngⅡ、尿白蛋白排泄率(UAER)。 结果 DM组 8周出现平均肾小球体积、肾重 /体重增加 ,UAER、血BUN和Cr水平上升(P <0 .0 5)。DM组肾皮质TβRⅡ和FNmRNA的表达明显增加 ,TGF β1、TβRⅡ和FNmRNA的表达也显著增加 (P <0 .0 5)。洛沙坦治疗 8周后 ,DL组平均肾小球体积、肾重 /体重减少 ,UAER、血BUN和Cr水平下降 (P <0 .0 5)。肾皮质TβRⅡ和FNmRNA的表达降低 ,TGF β1、TβRⅡ和FNmRNA的表达也降低 (P <0 .0 5)。 结论 洛沙坦对DM大鼠肾脏具有保护作用。其机制可能为洛沙坦下调TGF β系统的表达 ,后者抑制肾细胞肥大、减少细胞外基质 (ECM)

鼠反义转化生长因子βⅠ型受体真核表达质粒的构建与鉴定

目的:构建鼠反义转化生长因子βⅠ型受体(TβRⅠ)基因pcDNA3.1(+)真核表达质粒,为进一步研究通过TβRⅠ干预肝纤维化的发生发展提供实验基础.方法:将取冰冻保存的大鼠肝组织,应用TRIzol法提取总RNA,琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性,并用紫外分光核酸蛋白分析仪测定RNA浓度和纯度.使用一步法逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)试剂盒获得目的基因TβRⅠcDNA片段,采用巢式PCR扩增TβRⅠ基因片断.用CaCl2法诱导感受态细胞.将真核表达载体pcDNA3.1(+)在多克隆位点处用EcoRⅠ、XholⅠ双酶切线性化,切胶纯化回收;TβRⅠ基因片断双酶切后切胶纯化回收;将纯化回收的pcDNA3.1(+)线性化载体和TβRⅠ基因片段定向及反向连接,构建以pcDNA3.1(+)为载体的反义TβRⅠ基因真核表达质粒.转化JM109大肠杆菌.酶切证实的阳性克隆行测序分析.结果:琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性,见28S,18S条带完整,而且28S条带亮度为18S的1倍左右,认为RNA完整性良好;并用紫外分光核酸蛋白分析仪测定RNA纯度A260/A280=1.9150,认为RNA纯度良好;RNA浓度为770mg/L.阳性克隆质粒经双酶切后行10g/L琼脂糖凝胶电泳在DNAMarker430bp和线性化纯化后pcDNA3.1(+),5.3kb附近可见两条明显条带,与所需目的片段大小相符,证实为阳性克隆,重组质粒构建成功.DNA测序结果与预期目的片段序列一致.结论:鼠反义TβRⅠ/pcDNA3.1(+)真核表达重组质粒构建成功.

转化生长因子βⅠ型受体、Ⅰ型胶原在人皮肤增生性瘢痕组织周边区和中心区的表达

背景:近年来国内外学者对转化生长因子β及其受体的研究较多,但转化生长因子β受体1在增生性瘢痕组织周边区分布情况尚未见报道。目的:比较转化生长因子βⅠ型受体和Ⅰ型胶原在人皮肤增生性瘢痕组织周边区和中心区表达与分布。方法:收集新疆医科大学第一附属医院整形外科和新疆医科大学附属肿瘤医院乳腺、头颈外科1999/2002住院及门诊各类瘢痕手术患者30例,其中增生性瘢痕20例;非增生性瘢痕10例。取材瘢痕中心区、周边区及正常皮肤组织,每例6块共180块。用免疫组织化学方法检测组织转化生长因子βⅠ型受体、Ⅰ型胶原蛋白含量,对其阳性反应进行定量统计分析。结果与结论:增生性瘢痕组织转化生长因子βⅠ型受体、Ⅰ型胶原水平明显高于非增生性瘢痕组织和正常皮肤,且免疫阳性反应强。增生性瘢痕周边区转化生长因子βⅠ型受体含量100%,明显高于中心区20%(P<0.05);而Ⅰ型胶原中心区与周边区均为100%,差异无显著性意义。非增生性瘢痕周边区、中心区转化生长因子βⅠ型受体、Ⅰ型胶原差异无显著性意义(P>0.05);正常皮肤组织转化生长因子βⅠ型受体、Ⅰ型胶原含量极少。结果提示,增生性瘢痕周边区转化生长因子βⅠ型受体表达高于中心区,增生性瘢痕周边区的防治可能是临床防治工作的重点。

转化生长因子-β_1Ⅱ型受体基因在瘢痕疙瘩中改变的实验研究

目的通过检测瘢痕疙瘩中的转化生长因子-β1Ⅱ型受体(TβRⅡ)PolyA与CA重复序列两个基因突变热点的改变情况,论证瘢痕疙瘩是否与肿瘤具有相同的基因改变。方法选取瘢痕疙瘩标本20例、正常皮肤标本8例,提取标本中的DNA;在TβRⅡ基因PolyA位点和CA重复序列两个突变热点两侧设计并合成引物,利用PCR仪扩增,对PCR产物进行单链构象多态性分析(PCR-SSCP),PCR产物纯化后自动测序仪鉴定基因突变的位点和类型。结果PCR-SSCP显示,20例瘢痕疙瘩标本的TβRⅡPolyA位点有4例、CA重复序列有1例显示泳动条带较正常加快,且均缺失了1bp;基因测序发现,4例SSCP阳性的瘢痕疙瘩标本TβRⅡPolyA位点均出现一个A的缺失突变,正常皮肤基因序列正常;CA重复序列基因测序未见异常。结论瘢痕疙瘩组织中的TβRⅡPolyA和CA重复序列位点表现出类似肿瘤中所发现的基因缺失突变。

转化生长因子βⅡ受体在大鼠胰腺发育后期的表达

目的:探讨转化生长因子(TGF)-βⅡ受体在SD大鼠胰腺发育后期的表达及意义。方法:使用RT-PCR方法分别检测交配后18.5天、新生及成年SD大鼠胰腺TGF-βⅡ受体mRNA表达;使用Western blot方法分别对上述不同时期SD大鼠胰腺TGF-βⅡ受体表达进行蛋白质水平的检测。结果:新生鼠胰腺TGF-βⅡ受体表达在核酸与蛋白质水平上均明显高于18.5天胎鼠与成年鼠胰腺,差异有显著性(P<0.05)。结论:TGF-βⅡ受体表达在新生鼠阶段有明显上调。

转化生长因子β_1及其Ⅱ型受体在慢性胰腺炎大鼠中的表达

目的建立大鼠慢性胰腺炎模型,检测模型大鼠胰腺组织转化生长因子β1(transforming growth factor-β1,TGFβ1)及转化生长因子β1Ⅱ型受体(transforming growth factor-β1 type Ⅱ receptor,TβRⅡ)mRNA的表达。方法24只健康雄性Wistar大鼠,随机分为2组:模型组大鼠尾静脉注射二丁基二氯化物(dibutyltin dichlo-ride,DBTC)溶液7mg/kg,对照组仅注射相同体积的溶剂,28d时剖杀动物,采用HE染色和Masson染色观察两组大鼠胰腺组织病理变化,采用荧光定量PCR检测TGFβ1和TβRⅡ mRNA在胰腺组织的表达。结果模型组大鼠胰腺组织镜下可见纤维组织增生明显,胰腺小叶结构破坏或消失,腺泡萎缩;与对照组相比,模型组大鼠胰腺组织TGFβ1和TβRⅡ mRNA表达均升高(P<0.05)。结论TGFβ1和TβRⅡ在DBTC诱导的大鼠慢性胰腺炎胰腺组织表达升高。

转化生长因子β型受体Ⅰ基因RNA干扰慢病毒载体的构建及其在人胚肺成纤维细胞中的表达

目的:构建转化生长因子β型受体Ⅰ(transforming growth factor beta receptorⅠ,TGFβRⅠ)基因RNA干扰(RNA interference,RNAi)慢病毒载体并在人胚肺成纤维细胞株MRC-5上鉴定其沉默效应。方法:构建4种针对人TGFβRⅠ基因不同干扰靶点的慢病毒干扰载体,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定,将筛选出的4种有效重组慢病毒干扰载体和其它辅助质粒一起共转染293T细胞并测定病毒滴度。最后将4种重组的慢病毒干扰载体分别感染MRC-5细胞,采用Real-time PCR和Western blot检测它们对靶基因的沉默效率。结果:经双酶切鉴定和DNA测序,证实短发夹RNA正确插入慢病毒载体且插入的序列正确。4种重组慢病毒干扰载体经293T细胞成功包装后,其病毒滴度分别为:si RNA-1 6.37×107 TU/ml、si RNA-2 1.65×108 TU/ml、si RNA-3 4.50×108TU/ml、si RNA-4 2.31×108TU/ml,阴性对照组载体包装后的病毒滴度为:1.79×109 TU/ml。4种重组慢病毒干扰载体感染MRC-5细胞的效率均为93%左右。与正常对照组和阴性对照组比较,在感染4种重组慢病毒干扰载体(si RNA-1~4)后,MRC-5细胞内TGFβRⅠm RNA表达水平均明显下降(P=0.000),其中TGFβRⅠ-si RNA-2下降最明显,沉默效率最好。Western blot结果与q RT-PCR结果一致,4种重组慢病毒干扰载体均能使MRC-5细胞内TGFβRⅠ蛋白表达明显下降(P=0.000),且TGFβRⅠ-si RNA-2干扰效率最大。结论:筛选并构建了能有效沉默TGFβRⅠ基因的最佳RNAi重组慢病毒载体——TGFβR-si RNA-2,从而为后续研究奠定基础。

复方仙草颗粒对IgA肾病大鼠转化生长因子β_1及其Ⅱ型受体表达的影响

目的观察复方仙草颗粒对IgA肾病大鼠转化生长因子-β1(transforming growth factorβ1,TGF-β1)信号通路的影响。方法采用一侧肾切除、反复尾静脉注射葡萄球菌肠毒素B的方法,复制IgA肾病大鼠模型。将大鼠随机分为模型组,福辛普利组,复方仙草颗粒小、中、大剂量组,另设正常对照组,每组10只。治疗8周后检测24h尿蛋白、尿红细胞计数,采用RT-PCR法检测肾组织TGF-β1及其Ⅱ型受体(TβRⅡ)mRNA的表达,采用Western印迹法检测TGF-β1及TβRⅡ蛋白的表达,采用免疫组织化学法检测纤连蛋白(fibronectin,FN)的表达。结果与正常对照组比较,模型组24h尿蛋白,尿红细胞计数,TGF-β1、TβRⅡmRNA及其蛋白表达水平,以及FN表达水平显著升高(P<0.01);复方仙草颗粒能够剂量依赖性地降低上述指标的水平,其中复方仙草颗粒大剂量组上述指标的水平显著低于小剂量组(P<0.05,或P<0.01),复方仙草颗粒大剂量组在降低24h尿蛋白,TGF-β1mRNA及其蛋白,以及FN方面与福辛普利组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论复方仙草颗粒能延缓IgA肾病肾小球硬化,减轻血尿、蛋白尿,其作用机制可能与抑制TGF-β1信号通路有关。