EB病毒转化B淋巴母细胞在汉滩病毒CTL表位研究中的应用

目的:建立EB病毒转化B淋巴母细胞系(B-LCL),作为抗原提呈细胞(APC)提呈抗原肽,刺激短期培养的特异性T细胞活化并分泌IFN-γ,从而应用于T细胞表位鉴定中。方法:用B95-8细胞培养上清中的EB病毒转化肾综合征出血热(HFRS)患者PBMC,建立HFRS患者的B-LCL,以自身B-LCL为APC,加载抗原肽后,刺激短期培养的G9L特异的HFRS患者CD8+T细胞系,应用ELISPOT测定CD8+T细胞受到抗原肽刺激后产生IFN-γ的能力。结果:加载过抗原肽G9L或V15R的B-LCL可刺激G9L特异的CD8+T细胞活化并产生IFN-γ,而与G9L无同源序列的I15P则不能刺激G9L特异的CD8+T细胞活化。结论:B-LCL可作为非专职APC有效地将抗原肽提呈给特异性T细胞。

EBV转化的人乳头瘤病毒感染者B淋巴母细胞系的建立及应用

建立EB病毒(EBV)转化的B淋巴母细胞系(LCL),应用此细胞系作为抗原递呈细胞筛选抗原特异性的T细胞克隆。收集人乳头瘤病毒(HPV)感染者外周血20份,分离外周血单个核细胞(PBMC),利用Pan T细胞试剂盒去除PBMC中的T细胞,获得non-T淋巴细胞,EBV病毒转化non-T淋巴细胞。应用转化的LCL细胞作为抗原递呈细胞,ELISPOT筛选可能的HPV抗原特异性的T细胞克隆。成功建立18个LCLs,建株成功率为90%。转化成功的LCL细胞体积增大,聚集成团状或簇状。建株失败的两份标本,用于转化的non-T淋巴细胞数少于2×106。应用LCL细胞作为抗原递呈细胞筛选出64个HPV抗原特异性的T细胞克隆。成功建立LCLs,此细胞系细胞可作为体外研究HPV特异性免疫反应的刺激细胞。

环胞菌素A对建立EB病毒转化的B淋巴母细胞系的促进作用

建立有效的Ｂ淋巴母细胞系ＥＢ病毒转化法。利用免疫抑制剂环胞菌素Ａ选择性地抑制Ｔ细胞并阻止Ｂ细胞退化的作用，提高ＥＢ病毒转化人类淋巴细胞系效率，结果：建立了３０余株人类类淋巴母细胞系总成功率达９５％，比非ＣｙＡ法提高了５０％。结论：环胞菌素Ａ的应用可有效地建立淋巴细胞系，从而为保存特殊个体（如遗传病）的基因组并开展相应的研究奠定了基础。

阿司匹林诱导EB病毒转化的人B淋巴细胞凋亡

目的探讨阿司匹林诱导EB病毒转化的人B淋巴细胞凋亡及其机制。方法 EB病毒转化的人B淋巴细胞经一定浓度的阿司匹林处理后,首先通过MTT法分析细胞的增殖情况;然后用光学显微镜和电子显微镜、PI染色和流式细胞术分析以及琼脂糖凝胶电泳等方法对细胞凋亡进行评价;最后,通过免疫印记法检测凋亡相关蛋白、mTOR信号通路和PU.1-Bim信号通路蛋白表达情况。结果阿司匹林能抑制EB病毒转化的人B淋巴细胞增殖。形态学和超微结构观察发现,阿司匹林处理的细胞固缩变小、数目减少、细胞核畸形、染色质边缘化和细胞质空泡化。阿司匹林处理导致细胞膜通透性增加、细胞存活率明显下降和细胞DNA的弥散现象。免疫印迹分析显示,阿司匹林处理抑制了细胞的mTOR信号和转录因子PU.1的表达水平,激活了细胞凋亡相关蛋白caspase-3、PARP和Bim。结论阿司匹林可能通过抑制EB病毒转化的人B淋巴细胞增殖和诱导细胞凋亡表现一定的抗淋巴瘤效应,mTOR信号途径和PU.1-Bim轴可能参与了阿司匹林抗肿瘤作用机制。

用环胞菌素A建立EB病毒转化的人类若干遗传病的淋巴母细胞系

免疫抑制剂环胞菌素Ａ（ＣｙＡ），是一种真菌代谢物，能够选择性地抑制ＴＬＣ，防止ＢＬＣ的退化，将其引进ＥＢＶ转化的淋巴母细胞的建系过程，能够很大地提高建系的成功率，也是方法学上的一大突破。本研究采用ＣｙＡ，建立了ＥＢＶ转化的人类若干遗传病（共济失调４例、Ｗｉｌｓｏｎ氏病３例、Ｙｑ－综合征２例）、正常群体２０余株的淋巴母细胞系，为人类的医学遗传研究提供了一个库存基地。

β-胡萝卜素对病毒转化细胞的影响

目的 探讨β-胡萝卜素 (β- C)对病毒转化细胞的抑制作用 .方法 体外培养人腺病毒转化的 2 93细胞和 EB病毒转化的 Raji细胞 ,培养时添加 0 ,10 ,5 0和 10 0 μmol· L- 1的β- C作用 2 4,48和 72 h后 ,进行细胞计数 ,测定细胞生长抑制率 ;EL ISA-结晶紫方法测定 A值 ,计算细胞存活量 ;采用快速 CPE(细胞病变 )方法测定复制缺陷型腺病毒在 2 93细胞上的病毒滴度 .结果 10～ 10 0μmol· L- 1 的β- C对 2 93细胞和 Raji细胞均有抑制作用 ,细胞存活量减少 ,抑制率分别是15 .6 % ,10 .1% (10 μm ol· L- 1 ) ;19.7% ,2 2 .4% (5 0 μmol· L- 1 )和 33.6 % ,2 9.3% (10 0μmol· L- 1 ) ,P<0 .0 5 .快速CPE结果显示加入 β- C后 ,复制缺陷型腺病毒在其辅助细胞 -2 93细胞上的复制增殖能力明显下降 ,病毒滴度降低 ,空斑形成单位 (× 10 9pfu· L- 1 )分别为 98± 41(10μmol· L- 1 ) ,75± 2 9(5 0 μmol· L- 1 )和 6 3± 31(10 0 μmol· L- 1 ) ,与对照组 185±2 5 (0 μmol· L- 1 )相比 ,P<0 .0 5 .结论 β- C对病毒转化的2 93细胞和 Raji细胞的生长增殖具有明显的抑制作用 ,对 2 93细胞内整合的腺病毒早期基因

几种简单易行的EB病毒转化外周血淋巴细胞建系方法的比较

目的比较几种EB病毒建系方法的可行性。方法利用EB病毒(Epstein-Barrvirus,EBV)转化淋巴细胞建系的四种方法:即微量全血法,冻存全血法,冻存白细胞法和环孢霉素A(CyA)法,对全血淋巴细胞进行转化建系。结果四种方法均可成功建系,按建系效率从高到低依次为:环孢霉素A法、冻存白细胞法、冻存全血法和微量全血法。结论在血量充足的情况下,建议选择环孢霉素A法进行建系。

百脉根高频再生体系的建立及兔出血症病毒衣壳蛋白VP60基因的转化

以MS为基本培养基,通过调整激素种类与浓度等培养条件,按正交试验设计的原则,建立了百脉根高频再生体系。结果表明MS+2,4-D2.0mg/L+KT2.0mg/L培养基可高效诱导愈伤组织的形成,MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L培养基可高效诱导芽的分化,MS+NAA0.1mg/L培养基可快速诱导根的生成,形成再生植株。通过构建植物表达载体VP60-pBI121,研究了根癌农杆菌介导的兔出血症病毒(RHDV)衣壳蛋白VP60基因对百脉根遗传转化的影响因素,建立了百脉根快速高效遗传转化体系,结果表明,以农杆菌LBA4404为介导菌株、以下胚轴为外植体,预培养3d,在OD600为0.6的菌夜中浸染20min,共培养3d,以及300mg/L羧苄青霉素脱菌浓度和50mg/L卡那霉素筛选浓度为最佳转化条件。为利用百脉根生产动物口服型疫苗建立了技术基础。

EB病毒转化的永生性人B淋巴母细胞中MTHFR基因的表达

为检测用 EB病毒转化建立的永生性人 B淋巴母细胞株中 N5 ,N1 0 -亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因的表达及其 c DNA序列 ,用 EB病毒转化人外周血 B淋巴细胞 ,建立永生性细胞株后 ,从培养细胞中提取总 RNA,用 RT- PCR法扩增 MTHFR基因 c DNA的不同片段 ,进行 PAGE电泳分析和 c DNA序列测定。结果显示永生性人 B淋巴母细胞中有 MTHFR基因表达 ,其 c DNA序列与文献报道的人肝脏MTHFR基因 c

反义CD40 RNA对EB病毒转化的B细胞CD40分子表达和增殖能力的影响

目的 :探讨瞬时表达的反义CD4 0RNA ,对EB病毒转化的健康人B细胞膜表面CD4 0分子表达和增殖能力的影响。方法 :应用T A克隆技术和亚克隆技术 ,构建人反义CD4 0RNA的真核表达载体pcDNA3/CD4 0 ,并以其转染本室建立的EB病毒转化的健康人B细胞。应用流式细胞仪 (FACS) ,检测B细胞膜上CD4 0分子表达的变化。应用MTT比色法检测反义CD4 0RNA对B细胞增殖能力的影响。结果 :与转染空载体pcDNA3组相比 ,转染pcDNA3/CD4 0细胞上CD4 0分子的表达降低 (P<0 .0 1) ,其增殖能力明显降低 (P <0 .0 1)。结论 :反义CD4 0RNA技术 ,可作为有效的免疫调控手段。CD4

腺病毒介导转化生长因子β1对786-0肾癌细胞迁移与侵袭的影响

目的探讨腺病毒介导的转化生长因子β-1(TGF-β1)对肾癌细胞迁移与侵袭的影响。方法将肾癌细胞系786-0细胞培养后分实验组及对照组,实验组以腺病毒为载体将TGF-β1转染,采用细胞划痕实验检测TGF-β1对其迁移的影响;采用Transwell小室实验检测TGF-β1对其侵袭的影响。结果 48 h后实验组的划痕宽度明显变窄,且明显小于对照组(P<0.05);48 h后实验组的穿透细胞数明显多于对照组(P<0.05)。结论 TGF-β1能够促进肾癌细胞的迁移与侵袭。

经灭活脊髓灰质炎病毒免疫后再服减毒脊灰病毒的过程中有毒脊灰病毒转化的排泄情况

为研究先用EIPV(灭活脊髓灰质炎病毒)免疫后,对再接触活的病毒疫苗者大便中转化病毒的排泄是否有影响,我们进行了两组实验。第一组选用2个月,2～4个月及2、4个月和18或20个月的婴幼儿;分别服1剂、2剂和3剂以上OPV(减毒脊灰质病毒)后,再服OPV进行实验。第二组选择的实验对象同上。

用体外致敏联合EB病毒转化技术构建抗肝癌的人源Fab噬菌体抗体库

目的构建抗肝癌的人源Fab噬菌体抗体库。方法体外致敏并用EB病毒(EBV)转化肝癌患者的外周血单个核细胞(PBMC)。RT-PCR扩增人抗体轻链和重链Fd段基因,将抗体基因分别与载体pComb3连接后,电转化大肠杆菌XLI-Blue,构建噬菌体呈现型Fab抗体库。结果经EBV转化的4例肝癌患者PBMC,ELISA检测均有抗肝癌抗体产生;经PCR扩增出13条轻链基因片段(κ、λ)和28条重链Fd基因片段(γ);电转化构建的噬菌体抗体库库容为1.7×107puf/mL;Fab基因的重组率约为100%。结论用体外致敏法结合噬菌体抗体库技术,成功构建了全人源抗肝癌Fab组合抗体文库。

EB病毒转化HLA标准抗原B细胞株的建立及鉴定

本文报导应用EB病毒转化技术,建立7株人B淋巴母细胞样细胞株,其中4株为HLA标准抗原B细胞株。经免疫荧光染色及生物化学分析鉴定,所有细胞株均表达及合成HLAⅠ类和Ⅱ类抗原,可供HLA抗血清筛选及其它研究应用。

γδT细胞对EB病毒转化人类B淋巴细胞的免疫识别

目的 :研究γδT细胞对 EB病毒转化前后人类 B淋巴细胞识别的差异 ,寻找γδT细胞识别的肿瘤 /病毒感染诱生性抗原分子。 方法 :流式细胞仪检测 HSP6 0和 HSP70的表达 ,MTT法检测γδT细胞的杀伤作用 ,RT- PCR分析 MHC- 类链相关基因 A(MHC class chain- related gene A,M CA)的表达。结果 :HSP6 0和 HSP70分子以及 M CA基因在 EB病毒转化后细胞中高表达 ,γδT细胞对转化后细胞杀伤率明显增高 ,且其细胞毒作用能部分被抗 HSP6 0和 HSP70抗体所阻断。结论 :HSP6 0和 HSP70是 γδT细胞对 EB病毒转化后的 B淋巴细胞的识别靶点 ,但尚有其他抗原识别靶点 ,其中 M CA的可能性较大。

禽白血病/肉瘤病毒肿瘤基因及其与致肿瘤机制的关系

根据致瘤机制的差异,禽白血病/肉瘤病毒可以分为两大类,其差异主要在于所表达肿瘤基因的不同。慢性转化型病毒通过插入启动机制间接激活细胞原癌基因,肿瘤形成速度缓慢;急性转化型病毒则是直接转录表达病毒自身基因组中的病毒肿瘤基因,从而诱导肿瘤的快速形成。作者拟对禽白血病/肉瘤病毒肿瘤基因及其与致肿瘤机制的关系进行综述。

EBV转化B型健康人B淋巴细胞构建噬菌体抗体库

目的构建人源抗红细胞A抗原单链噬菌体抗体库。方法应用EB病毒转化方法和噬菌体抗体库技术,从EB病毒转化成功的B型个体淋巴细胞中提取总RNA,逆转录合成cDNA第一条链,PCR分别扩增VH和Vκ基因,经重叠延伸拼接法(SOE)组成ScFv基因并将其克隆入pCANTAB5E,转化E.coliTG1,加入辅助噬菌体M13KO7援救,构建人源抗红细胞A抗原单链噬菌体抗体库,并测定文库的库容、滴度及ScFv基因的插入率。使用完整A型红细胞对该库进行4轮“吸附-洗脱-扩增”的筛选,细胞ELISA、红细胞血凝实验对所获抗体进行初步鉴定。结果所构建的噬菌体抗体库,其库容为1.2×106,噬菌体DNA中全长ScFv基因的插入率为0.90,用辅助噬菌体援救后,得到滴度为2.52×1010PFU/mL的初级噬菌体抗体库。以完整A型红细胞进行四轮淘筛,出现特异性富集。经细胞ELISA、红细胞血凝实验鉴定,得到2株与A型红细胞特异结合的ScFv噬菌体抗体。结论EB病毒转化方法联合噬菌体展示技术构建噬菌体抗体库切实可行,可进行亲和筛选以得到人源抗红细胞A抗原的基因工程抗体。

用EBV转化的大肠癌患者B细胞构建噬菌体抗体库

目的 构建全人源化的噬菌体抗体库。方法 采用ＥＢＶ转化技术，ELISA技术，PCR技术，噬菌体表面呈现技术。结果 EBV转化8例大肠癌患者PBMC，其中七例有抗大肠癌抗体产生，多次PCR扩增出VH（γμ）和9种VL（κ，λ）基因，经简并组合成15种ScFv基因。在体外与表达载体fUSE5连接，电导入大肠杆菌MC1061，经四环素抗性筛选，得到库容为1．1×10^7的初级噬菌体抗库。全长ＳvFv基因的插入库为７０％。结论 应用ＥＢＶ转化技术联菌体抗体库技术，制备全人源化的抗肿瘤单链抗体（SvFv)，这一策略是完全可行的。

用EBV转化的肝癌患者B细胞构建噬菌体单链抗体库

目的构建抗肝癌人源噬菌体单链抗体库。方法体外致敏并用EBV转化肝癌患者的PBMC。用PCR分别扩增VH和VL基因并组成ScFv基因。将ScFv基因与载体连接后,转化大肠杆菌MC1061,构建噬菌体呈现型ScFv库。结果经EBV转化的4例肝癌患者PBMC,ELISA检测均有抗肝癌抗体产生,经多次PCR,扩增出6种VH(γ、μ)和9种VL(κ、λ)基因,经连接组成54种ScFv基因。将ScFv基因与载体连接后,导入大肠杆菌MC1061。经四环素抗性筛选,得到库容为1.0×108的初级噬菌体抗独特型抗体库,噬菌体DNA中全长ScFv基因的插入率为80%。结论用体外致敏法结合噬菌体抗体库技术,制备全人源抗肿瘤单链抗体(ScFv),这一策略是完全可行的。