转双基因(pGH/IGF-Ⅰ)猪胎儿成纤维细胞系的建立及鉴定

本研究旨在建立转双基因(pGH/IGF-Ⅰ)猪胎儿成纤维细胞系,保存转双基因猪的成纤维细胞以便于后续细胞水平研究。试验采用胰蛋白酶消化法对猪胎儿躯干组织进行原代培养,通过原代培养、细胞传代、冷冻保存等成功分离出转双基因猪胎儿成纤维细胞,并对细胞进行了形态学观察、冻存前和复苏后细胞活力检测、生长动力学分析、波形蛋白免疫组化及微生物污染检测等生物学特性分析。结果显示,原代细胞经过胰蛋白酶消化和差速离心分离培养出成纤维细胞,冻存前细胞活力为94.3%,冻存3个月后细胞复苏后活力为91.2%;细胞生长总趋势呈"S"型,经历了潜伏期、指数生长期和平台期3个阶段;细胞波形蛋白在成纤维细胞中呈阳性反应;细胞的细菌、真菌、病毒和支原体检测均为阴性。结果表明本试验成功建立了转双基因猪成纤维细胞系。

F1代转pGH、IGF-1双基因猪的阳性鉴定及其差异性表达

为了探究转pGH、IGF-1双基因猪F1代阳性率及表达差异情况,试验采用PCR、测序及荧光定量PCR检测转pGH、IGF-1双基因猪的mRNA表达水平。结果表明:53头F1代猪中17头为阳性猪,阳性率为32.08%,证实外源pGH和IGF-1基因已遗传到F1代中;1月龄到4月龄转双基因猪与非转基因猪IGF-1和pGH基因平均表达量均无显著性差异(P>0.05);5月龄转双基因猪pGH和IGF-1基因平均表达量分别是非转基因猪的1.98倍和2.00倍,存在显著差异(P<0.05);6月龄转双基因猪pGH和IGF-1基因平均表达量分别是非转基因猪的1.67倍和1.73倍(P<0.05)。说明pGH、IGF-1双基因已遗传至F1代猪中,并且能够在猪体内稳定表达。