转反义LeETR1基因番茄采后生理特性的研究

转反义LeETR1乙烯受体基因番茄的采后生理性状与普通番茄不同。转基因番茄的呼吸作用受到抑制 ,呼吸高峰只有对照的 5 2 % ,乙烯释放高峰的出现比对照果实推迟 10d。转基因番茄的叶绿素降解和番茄红素的合成受到显著抑制 ,果实不能形成正常的红色。在成熟过程中 ,转基因番茄的纤维素酶、多聚半乳糖醛酸酶活性显著低于对照 ,延缓了果肉的软化。

LeETR1反义基因对番茄的遗传转化

从番茄果实中提取总RNA,根据GeneBank中LeETR1序列,设计合成特异性引物,利用RT-PCR技术克隆了LeETR1基因3’端非编码区313 bp的cDNA,经酶切图谱和序列分析鉴定无误后,反向插入到植物表达载体pPZP111A中,构建了表达LeETR1反义RNA的双元载体。经农杆菌途径转化番茄品种B1后,通过PCR检测从抗卡那霉素再生植株中筛选到13株阳性植株,Southem blot杂交确证反义基因已经整合到番茄染色体中。对果实乙烯释放的测定结果表明,转基因番茄乙烯释放高峰的出现比对照果实推迟10天,番茄红素的合成受到显著抑制,果实不能形成正常的红色。推测LeETR1和番茄的成熟有着密切的关系。

反义LeETR1转基因番茄的生殖发育毒性及外源基因转移试验

目的评价反义LeETR1转基因番茄(ETR1)向动物肠道菌群和子代动物转移外源基因的能力及对小鼠生殖发育的影响。方法SD大鼠和ICR小鼠连续饲喂ETR1、非转基因番茄(B1)和蒸馏水30 d后,分别进行大鼠盲肠菌群培养物的抗生素耐药性试验及小鼠生殖毒性试验,提取耐药阳性菌、亲代和子代小鼠的基因组进行外源基因特异性聚合酶链式反应法(PCR)。结果肠道菌的耐药性和小鼠生殖发育情况无明显改变,在耐药菌和两代小鼠体内均未发现由受试物引入的外源基因。结论ETR1对小鼠无生殖毒性,其携带的外源基因不能向动物体细胞、肠道菌及子代动物转移。

PIN1反义基因转染抑制人骨肉瘤细胞的增殖

目的观察以pIRES2-EGFP质粒为载体的PIN1反义基因转染对人骨肉瘤细胞增殖的抑制作用。方法不同量(0、20、50、100、200、250μL)的PIN1反义基因以pIRES2-EGFP质粒为载体包装后转染人骨肉瘤MG-63细胞,收集转染前后的培养细胞和上清液,MTT法观测转染前后细胞生长曲线;流式细胞仪观测细胞生长周期变化和细胞凋亡情况;Western blot法检测PIN1蛋白的表达变化;逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测PIN1mRNA表达变化。结果MTT法和流式细胞仪检测显示反义PIN1基因转染后,MG-63细胞生长受到抑制,且其凋亡被促进;Western blot结果表明转染反义PIN1基因的量越多,其PIN1蛋白表达量越低,测得空白对照组及不同量转染组的光密度比值分别为0.854±0.136、0.866±0.138、0.732±0.154、0.611±0.121、0.547±0.109、0.398±0.113、0.320±0.151,差异有显著性(P<0.05);RT-PCR检测其光密度比值分别为0.983±0.125、0.988±0.127、0.915±0.157、0.786±0.125、0.608±0.124、0.433±0.130、0.410±0.158,差异有显著性(P<0.05)。结论反义PIN1基因可封闭PIN1mRNA,使MG-63细胞表达的PIN1蛋白减少,从而抑制人骨肉瘤MG-63细胞增殖。

反义转化生长因子β1基因逆转的骨肉瘤细胞对肿瘤侵袭和转移的预防意义(英文)

背景:转化生长因子β1(transforminggrowthfactorβ1,TGFβ1)能通过自分泌和旁分泌机制促进肿瘤细胞的生长,最近有研究表明反义TGFβ1基因转染骨肉瘤细胞后可以降低肿瘤细胞的增殖活性。目的:观察反义TGFβ1基因对骨肉瘤细胞恶性表型的逆转作用,探讨其预防骨肉瘤的发生、发展的意义。设计:完全随机设计,对照实验研究。地点和材料:研究地点为华中科技大学同济医学院附属协和医院骨科实验室。TaqDNA聚合酶、TRIzolTM试剂、SuperscriptPreamplificationSystem、胎牛血清、DMEM培养基、Lipofectamine、无血清培养基、G418、PCR引物、反义TGFβ1表达质粒pcDNA3-TGFβ1(-)、人骨肉瘤细胞系MG-63、Balb/c裸鼠、流式细胞仪、CO2培养箱、相差显微镜。方法:将反义TGFβ1基因转染骨肉瘤细胞MG-63后,检测细胞周期、细胞凋亡和明胶酶A表达,并观察转染细胞软琼脂克隆形成数和裸鼠体内致瘤能力。主要观察指标:细胞周期和细胞凋亡检测;RT-PCR检测MMP-2基因表达;软琼脂培养克隆形成实验;裸鼠体内成瘤性的检测。结果:与MG-63和空载体转染细胞MG-pcDNA3相比,反义基因转染细胞MG-TGFβ1(-)的G0/G1期细胞从56.2%和60.1%增至71.6%,S期细胞从19.1%和17.8%降至12.9%,MMP-2mRNA表达明显减少。MG-TGFβ1(-)的软琼脂克隆形成数从48.

反义cyclinD1基因转染对人角膜基质细胞增生的影响

目的探讨反义cyclinD1基因转染后人角膜基质细胞增生的改变。方法人角膜组织来源于北京大学第一医院眼库体外培养人角膜基质细胞,采用第2代或第3代细胞用于实验。利用阳离子脂质体lipofectamine介导反义cyclinD1基因转染入体外培养的人角膜基质细胞。同时设非转染组(以PBS代替cyclinD1质粒及lipofectamine)及lipofectamine转染组(以PBS代替反义cyclinD1质粒)作为对照。应用免疫细胞化学法观察lipofectamine介导反义cyclinD1基因转染对人角膜基质细胞中cyclinD1蛋白表达的影响,应用四甲基偶氮唑盐(MTT)法观察其对人角膜基质细胞增生的影响,并用质量分数0.5%锥虫蓝染色观察活细胞比率。结果非转染组和lipofectamine转染组均有大量人角膜基质细胞的细胞核cyclinD1染色呈棕褐色,反义cyclinD1转染组只有少量人角膜基质细胞细胞核cyclinD1染色呈棕褐色。与非转染组和lipofectamine转染组比较,反义cyclinD1转染组在转染后2、6、10dcyclinD1蛋白在培养的人角膜基质细胞中的表达明显降低,差异均有统计学意义(t=6.050、t=5.180、t=5.040,P<0.01;t=6.190、t=5.670、t=5.010,P<0.01),而非转染组与lipofectamine转染组间比较,差异均无统计学意义(t=1.120、t=1.310、t=1.010,P>0.05)。转染后2、6、10d,反义cyclinD1转染组人角膜基质细胞的A570值分别低于非转染组和lipofectamine转染组,差异均有统计学意义(t=5.830、t=5.210、t=4.920,P<0.01;t=5.130、t=5.010、t=4.850,P<0.01),说明抑制了基质细胞的增生,而非转染组与lipofectamine转染组间比较,差异均无统计学意义(t=1.110、t=1.230、t=1.120,P>0.05)。0.5%锥虫蓝染色显示各组活细胞比率均在90%以上,未见明显的细胞毒性。结论阳离子脂质体介导的反义cyclinD1基因转染在转染后一定时间内可降低人角膜基质细胞中cyclinD1蛋白的表达,抑制人角膜基质细胞的增生,未见明显细胞毒性,为角膜基质过度愈合反应的基因治疗奠定了基础。

TGF-β1,反义c-myc和反义bcr/abl基因转导诱发细胞凋亡的电镜观察(英文)

程序性细胞死亡(programmed cell death,PCD)是一主动性细胞“自杀”过程,是细胞内部基因引导的一系列精密生化级联反应的结果。凋亡(apoptosis)是PCD的形态学指征,探讨何种基因并以何种途径诱发PCD是当前研究的热点,也是本研究的动机。基因转导是从分子水平研究基因调控的一种手段。本研究采用基因转导法结合电镜观察细胞凋亡,选择的目的基因分别是构建在真核表达载体pMAMneo中人TGF-β1cDNA基因全长,采用磷酸钙共沉淀法,体外转染贴壁生长的人肺巨细胞癌PLA-801D株细胞,以及构建在逆转录病毒载体pDORneo中的反义c-myc、反义bcr/abl基因片段,采用Lipofectin体外转染悬浮培养的人白血病HL-60或K562细胞,除进行一系列分子细胞生物学指标的检测外,重点对转染后不同阶段细胞进行了透射电镜观察。结果发现转染TGF-β1的人肺癌细胞多呈现典型的“凋亡”改变;核异染质凝聚呈“半月形”、细胞出芽(budding),形成大量“凋亡小体”,胞浆细胞器尚完好,凋亡小体内亦见完整压扁的细胞器,并可见吞噬有染色质凝块的癌细胞,而转染反义c-myc,反义bcr/abl的HL-60或K562细胞更多出现核“新月体”,亦见“球形”、“面包圈”状凝聚异染质,并见吞噬“凋亡小体”现象。转染TGF-β1细胞DNA电泳呈现的“DNA梯带”

反义cyclinD1基因转染后人角膜基质细胞增生改变的实验研究

目的探讨反义cyclinD1基因转染对人角膜基质细胞增生的作用效果。方法从沈阳军区总医院眼库获取人角膜组织,体外培养获得第2代人角膜基质细胞用于实验。阳离子脂质体lipofectamine介导进行反义cyclinD1基因转染(实验组),对照组分别为PBS替代cyclinD1质粒及lipofectamine(对照1组)和PBS代替cyclinD1质粒(对照2组)。通过免疫细胞化学法统计人角膜基质细胞的cyclinD1蛋白表达情况,利用四甲基偶氮唑盐法分析人角膜基质细胞增生情况,锥虫蓝染色计算活细胞比率。结果反义cyclinD1转染后,人角膜基质细胞仅有少量细胞核cyclinD1染色呈阳性,cyclinD1蛋白表达明显降低,A570值显著下降,与对照1组和对照2组比较,差异存在显著性(P<0.05)。对照1组和对照2组比较,差异无显著性(P>0.05)。锥虫蓝染色显示3组活细胞比率均超过90%。结论反义cyclinD1基因转染具有抑制人角膜基质细胞增生的作用,并且细胞毒性不明显,可以作为基因治疗的相关依据。

反义周期蛋白B1基因抑制HT29细胞的增殖

用ＤＮＡ重组技术将人类ｃｙｃｌｉｎＢ１基因的全长ｃＤＮＡ，反向插入到真核表达载体ｐＸＪ４１－ｎｅｏ的ＢａｍＨ１位点，得到ｃｙｃｌｉｎＢ１基因的反义ＲＮＡ表达载体ｐＡＳ－Ｂ１。利用ＤＮＡ磷酸钙共沉淀方法，将ｐＡＳ－Ｂ１转染进ＨＴ２９细胞。在含有Ｇ４１８的培养基中，挑选出独立的细胞克隆。利用ｃｙｃｌｉｎＢ１ｃＤＮＡ作探针，Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ杂交鉴定出一株内源性ｃｙｃｌｉｎＢ１ｍＲＮＡ受到抑制的细胞株ＨＴＢ１。比较ＨＴＢ１与对照细胞ＨＴ２９发现，ｃｙｃｌｉｎＢ１的反义ＲＮＡ明显抑制ＨＴ２９细胞的增殖，细胞内３Ｈ－ＴｄＲ参入量减少。流式细胞光度术分析，处于Ｇ１期细胞比率的升高与Ｓ期、Ｇ２＋Ｍ期细胞数量的下降都十分显著。

高迁移率族蛋白框1反义核酸抑制人胰腺癌细胞系PCNA-1侵袭的研究

背景与目的:研究证明高迁移率族蛋白框1(highmobilitygroupbox1,HMGB1)在大多数未成熟及恶性肿瘤细胞中高表达,它与细胞增殖、侵袭、转移有密切关系。我们前期的研究证明HMGB1在胰腺癌组织中高表达并与肿瘤的侵袭及转移显著性相关。本研究的目的是观察HMGB1反义核酸对胰腺癌PCNA-1细胞体外侵袭能力的影响,并探讨其作用机制。方法:以脂质体介导方法将HMGB1反义表达载体转染胰腺癌细胞株PCNA-1,采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测HMGB1、基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinase-2,-9,MMP-2,MMP-9)mRNA的表达,Westernblot法检测HMGB1蛋白表达,明胶酶谱法(gelatinzymography)检测MMP-2和MMP-9活性的变化,Boyden小室法检测PCNA-1的体外侵袭能力。结果:HMGB1反义核酸明显抑制PCNA-1细胞HMGB1mRNA和蛋白的表达。转染后,MMP-2及MMP-9mRNA表达和酶活性亦受到显著抑制(P<0.01)。另外,HMGB1反义核酸的导入显著减弱了胰腺癌细胞的跨膜侵袭能力(P<0.01)。结论:HMGB1在胰腺癌侵袭转移中,阻断HMGB1基因的表达,可能是阻抑胰腺癌转移的一种新策略。

反义核苷酸抑制人高迁移率族蛋白1表达对胰腺癌细胞的影响

目的 构建高迁移率族蛋白 1(HMGB1)基因的反义真核表达载体 ,寻找胰腺癌基因治疗新途径。方法应用分子克隆技术构建HMGB1基因反义真核表达载体 pcDNA3 1/antisense HMGB1,转染胰腺癌细胞株PANC 1,通过逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)、免疫印迹法 (Westernblot)、噻唑蓝 (MTT)比色法检测转染 4 8h后胰腺癌细胞HMGB1基因表达和体外增殖活性的变化。结果 成功构建 pcDNA3 1/antisense HMGB1反义真核表达载体。所获反义表达载体 pcDNA3 1/antisense HMGB1转染可使PANC 1细胞HMGB1mRNA和蛋白表达水平显著降低 (P <0 0 1)。反义 pcDNA3 1/antisense HMGB1的导入能有效抑制PANC 1增殖活性 (P <0 0 1)。 结论 应用反义RNA技术阻断HMGB1基因的表达 ,能有效抑制癌细胞的体外增殖活性 。

纳米粒子作为基因载体在不同动物模型上的基因转染效果

目的验证包载反义单核细胞趋化蛋白-1(A-MCP-1)质粒的聚乳酸聚乙醇酸共聚物(PLGA)纳米粒子在不同动物模型上的基因转染效果。方法采用乳化溶剂挥发法制备A-MCP-1纳米粒子并进行体外物化表征。用血管平滑肌细胞进行体外基因转染,PCR法检测其转染效果。兔移植静脉内膜增生模型和大鼠腹主动脉瘤模型体内局部给予A-MCP-1纳米粒子,应用病理形态学分析、斑点杂交、原位杂交、Western blot等方法观察其在体内的基因转染效果和对内源性MCP-1基因表达的抑制作用。结果基因纳米粒子平均粒径为201·4nm,基因含量为4·14%,基因的包封效率为86%,体外可维持稳定释放两周以上。兔移植静脉内膜增生基因纳米粒子组的动脉组织中检测到明显的A-MCP-1表达,并抑制了正义MCP-1表达,内膜/中膜比为0·56±0·06,与对照组比较差异具有显著性(P<0·05),与阳离子脂质体1,2-二油酰-3-三甲铵基丙烷(DOTAP)诱导的A-MCP-1质粒组比较,差异无显著性。大鼠腹主动脉瘤模型体内转染2周后,基因纳米粒子组腹主动脉直径为(1·79±0·12)mm,明显小于空白纳米粒子悬浮液组(2·58±0·21)mm和生理盐水组(2·63±0·29)mm(P<0·01)。MCP-1基因的mRNA和蛋白表达水平分别为12·5±1·5,17·6±2·1,明显低于空白纳米粒子悬浮液组35·7±4·5,42·3±5·7(P<0·01),生理盐水组32·4±3·9,39·8±4·8(P<0·01)。结论A-MCP-1基因纳米粒子用于兔移植静脉内膜增生模型以及大鼠腹主动脉瘤模型成功实现基因转染的研究结果,显示了其应用于临床的巨大潜力。

阻断转化生长因子β1自分泌环对骨肉瘤细胞恶性表型的影响

[目的]观察阻断转化生长因子β1(TGFβ1)自分泌环对骨肉瘤细胞恶性表型的影响。[方法]将反义TGFβ1基因转染骨肉瘤细胞MG-63,G418筛选14d后获得转染细胞系MG-TGFβ1(-)。取MTT法检测转染细胞增殖活性,并观察细胞软琼脂克隆形成数和裸鼠体内致瘤能力。[结果]与MG-63和空载体转染细胞MG-pcDNA3相比,MG-TGFβ1(-)细胞增殖活性明显受到抑制。MG-TGFβ1(-)的软琼脂克隆形成数(28·2±5·6)比MG-63组(48·6±8·1)和MG-pcDNA3组(45·2±4·7)明显减少,裸鼠体内形成肿瘤的体积(83·4±27·4)mm3也明显小于MG-63组(191·3±21·5)mm3和MG-pcDNA3组(204·2±30·7)mm3。[结论]反义TGFβ1基因转染骨肉瘤细胞可以逆转肿瘤细胞的恶性表型,进一步的研究将有助于提高骨肉瘤的治疗效果。

单核细胞趋化蛋白1反义寡核苷酸抑制大鼠腹主动脉瘤的形成

为了观察单核细胞趋化蛋白 1对腹主动脉瘤形成的影响 ,建立大鼠腹主动脉瘤模型 ,局部转染单核细胞趋化蛋白 1基因的反义寡核苷酸。结果表明 :动脉灌注 3d ,苏木素—伊红染色即可见明显的炎性细胞浸润 ,逆转录聚合酶链反应提示单核细胞趋化蛋白 1的mRNA表达在灌注 14d达高峰 ,蛋白印迹及免疫组织化学染色提示蛋白产物均在 14d达到高峰 ,并且与动脉瘤的形成呈平行关系。反义寡核苷酸可以抑制单核细胞趋化蛋白 1基因的mRNA及蛋白产物表达 (P <0 .0 1) ,延缓腹主动脉瘤形成 ,抑制率为 92 %～ 12 5 % ,并存在一定的量效关系。本研究提示单核细胞趋化蛋白 1参与腹主动脉瘤的形成 ,反义技术可以减少单核巨噬细胞浸润并抑制腹主动脉瘤的形成和发展。

TGFβ_1反义RNA对腹膜间皮细胞分泌细胞外基质的影响

目的 :研究转化生长因子 β1(TGFβ1)反义RNA对体外培养的人腹膜间皮细胞 (HPMC)细胞外基质合成与分泌的影响。方法 :将反义TGFβ1基因真核表达载体转染HPMC ,用ELISA法检测转染细胞上清液中纤维连接蛋白 (FN)和Ⅰ型纤溶酶原激活物抑制剂 (PAI 1)的蛋白质水平 ;用半定量逆转录多聚酶链反应 (RT PCR)法检测转染细胞内FN ,PAI 1和胶原Ⅰ (ColⅠ )的mRNA表达 ,并与未转染HPMC对照组和转染空载体组比较其变化。结果 :TGFβ1反义RNA转染HPMC后 ,与对照组相比 ,转染 2 4h后 ,FN ,ColⅠ ,PAI 1mRNA分别下调 17% ,2 6 % ,9.6 % ;转染 4 8h后FN ,PAI 1蛋白含量亦明显下降 (P <0 .0 5 )。结论 :人反义TGFβ1基因真核表达载体可抑制HPMC合成细胞外基质 。

磷酸胆碱聚合物MPC_(30)-DEA_(70)负载转化生长因子β1AS-ODN转染心肌细胞

背景:目前反义寡核苷酸的基因治疗已经拥有良好的应用前景,但是反义寡核苷酸的相对分子质量小却不容易入细胞并且易被核酸酶降解,能否有效地穿过细胞膜且不被核酸酶降解从而与目的基因结合发挥作用,因此人们一直致力于理想载体的选择、基因转移效率的增加和转移特异性等研究。目的:探讨新型阳离子磷酸胆碱聚合物MPC30-DEA70能否有效地负载转化生长因子β1反义寡核苷酸(AS-ODN)进入心肌细胞,并观察其对该基因胞内生物表达的影响。方法:按不同N/P电荷比值将载体MPC30-DEA70与转化生长因子β1 AS-ODN络合成形成基因复合物并且对其总电性进行表征;采用MTT法检测MPC30-DEA70与心肌细胞的生物相容性;共聚焦激光扫描显微镜观察MPC30-DEA70/TGF-β1AS-ODN在细胞内的分布和定位;应用流式细胞仪检测MPC30-DEA70/TGF-β1AS-ODN(FAM标记)的细胞转染效率和荧光强度;Western blot、RT-PCR法检测转化生长因子β1细胞内表达水平。结果与结论:MPC30-DEA70与心肌细胞具有较好的细胞相容性,在较高质量浓度(>20 mg/L)下才表现出一定的细胞毒性并呈剂量依赖;MPC30-DEA70/TGF-β1AS-ODN复合物对心肌细胞具有较高的转染效率,并且能够携带转化生长因子β1 AS-ODN进入细胞后下调转化生长因子β1 m RNA和蛋白的表达。新型阳离子磷酸胆碱基聚合物MPC30-DEA70可以有效负载和运输转化生长因子。

反义转化生长因子-β1基因对骨肉瘤细胞表达转移相关因子的影响

目的 探讨反义转化生长因子(TGF) β1基因转染对骨肉瘤细胞MG 63表达基质金属蛋白酶(MMPs)和尿激酶型纤溶酶原激活因子(uPA )等肿瘤转移相关因子的影响。方法 将反义TGF β1基因转染MG 63 ,G418筛选转染细胞后,采用Northernblot法检测转染细胞MMP 2、MMP 9和uPA的表达情况。结果 反义TGF β1基因转染骨肉瘤细胞上清培养的Mv 1 Lu细胞增殖活性为0 .975±0 .0 16(对照组1.0 3 2±0 .0 2 7,P >0 .0 5 ) ;Northernblot法检测显示MMP 2和uPAmRNA的表达明显降低。结论 通过反义基因技术阻断骨肉瘤细胞TGF β1自分泌环,在降低肿瘤细胞TGF β1表达的同时,也降低了转移相关因子MMP 2、uPA的表达。

hPARP-1蛋白缺陷细胞株建立及生长特性

目的建立hPARP-1蛋白缺陷细胞株,观察该缺陷所引起的生物学效应。方法用构建的hPARP-1基因反义RNA绿色荧光蛋白真核表达载体(pEGFP-C1-P)转染人胚肺成纤维细胞(HLF),用蛋白免疫印迹法鉴定转染细胞中hPARP-1基因的表达水平。同时观察转染细胞生长形态,绘制生长曲线,用流式细胞术观察细胞周期,软琼脂培养法鉴定转染细胞恶性程度。结果pEGFP-C1-P载体在转染细胞内可较稳定表达,hPARP-1蛋白缺陷细胞株hPARP-1基因的蛋白表达水平比HLF下降了47%,比绿色荧光蛋白载体(HLFC)低45%,HLFC比HLF仅少3%。转染后hPARP-1蛋白缺陷细胞生长形态、生长速度无明显变化,软琼脂培养未见细胞集落。hPARP-1缺陷细胞生长形态无明显变化,细胞倍增时间为0.89 d,与HLF细胞0.93 d接近,软琼脂培养未见细胞集落。结论成功建立和鉴定了hPARP-1蛋白缺陷细胞株,在正常生长环境中,该缺陷不足以单独引起可观察的生长特性改变。

纳米粒子载体携带反义转化生长因子-β1基因的局部定位转染对大鼠自体移植静脉内膜增生的影响

目的探讨纳米粒子携带反义转化生长因子(TGF-)β1局部定位转染对大鼠自体移植静脉内膜增生的影响。方法45只大鼠制成自体静脉移植模型后,分成纳米粒子DNA组、纳米粒子空载体组和生理盐水对照组,进行局部定位转染,2周后观察移植静脉内膜的变化,应用逆转录聚合酶链反应(RTPCR)、Westernblot以及免疫组织化学等方法检测反义基因对内源性TG-Fβ1表达的影响。结果基因转染后两周,内膜厚度为(20.5±4.7)μm,明显小于两个对照组(P<0.01)。RTPCR和Westernblot结果表明,基因转染组的TGF-β1mRNA和蛋白的表达明显低于空载体组及生理盐水对照组。结论纳米粒子可有效地作为基因的转移载体;纳米粒子携带反义TGF-β1可以减少内源性TGF-β1基因的表达,抑制细胞外基质(ECM)的合成,从而达到抑制内膜增生的目的。

α_1(I)型前胶原基因反义寡核苷酸转染人瘢痕成纤维细胞的条件优化

目的优化α1(I)型前胶原基因反义寡核苷酸(ASODN)转染人增生性瘢痕成纤维细胞的条件。方法ASODN经FITC标记,以阳离子脂质体Oligofectamine为载体转染体外培养的第2～6代人增生性瘢痕成纤维细胞,转染后24h激光共聚焦显微镜下记录荧光素的细胞内分布;流式细胞术计数荧光细胞百分率、作细胞凋亡分析,以荧光细胞百分率最高者为最佳转染效率,依次筛选细胞接种数量、ASODN浓度和脂质体量。结果(1)脂质体转染ASODN,所用各转染条件未引起成纤维细胞凋亡;转染后细胞浆和细胞核内均有荧光素聚集。(2)接种细胞数量为14.25×104个/孔的荧光细胞百分率为74.0%,接种数量为30.00×104个/孔的为73.3%,接种数量为32.25×104个/孔的为94.3%,接种数量为39.00×104个/孔的为64.2%。(3)转染液中ASODN浓度100nmol/L,荧光细胞百分率为38.1%;150nmol/L时,为62.6%;200nmol/L时49.5%;250nmol/L时35.8%。(4)转染所用的脂质体量2μl时,荧光细胞百分率为77.01%,3μl时85.05%,4μl为71.64%。结论α1(I)型前胶原基因ASODN脂质体转染人增生性瘢痕成纤维细胞的最佳转染条件为接种细胞数量32.25×104个/孔,反义核酸浓度150nmol/L,脂质体3μl/孔。通过优化转染条件可提高转染效率,为下一步设计药物开发研究提供基础。