转反义LetAPX基因番茄抗氧化酶活性在苗期、花期、果期的变化

以番茄叶片为材料,研究在正常种植环境下转反义LetAPX(番茄叶绿体抗坏血酸过氧化物酶)基因番茄叶片中APX酶活性与非转基因番茄叶片在花期、苗期、果期酶活性的差异,以及对番茄叶片中过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)等酶活性的影响。结果表明,转反义LetAPX基因番茄叶片APX酶活性在苗期、果期均低于非转基因番茄,却在花期高于非转基因番茄。SOD在苗期、花期略低于非转基因番茄,而在果期高于非转基因番茄。POD在苗期、花期略高于非转基因番茄,而在果期低于非转基因番茄。CAT在苗期低于非转基因番茄,在花期高于非转基因番茄,而在果期与非转基因番茄基本相当。研究结果表明在正常种植条件下,过量表达反义LetAPX基因确实可以抑制番茄苗期、果期APX基因的表达,降低其酶活性,但APX酶活性的抑制同时影响着植物体内抗氧化酶系统,使得SOD、POD、CAT等酶活性都发生了改变,说明叶绿体APX基因对于植物抗氧化酶系统有重要影响。

人环氧合酶-2(hCOX-2)编码基因的克隆及其反义核酸转染胃癌细胞的初步研究

目的环氧合酶-2与肿瘤发生的关系已成为肿瘤研究的新热点之一,本研究旨在获得 hCOX-2编码基因序列,构建其正、反义真核表达载体,并用反义重组载体转染 COX-2高表达的胃癌细胞,以进一步研究其生物学作用及其在肿瘤发生中的作用机制。方法按文献报道的hCOX-2核苷酸序列设计合成 PCR 引物,利用总 RNA 抽取试剂盒从 COX-2高表达的培养的人胃癌细胞系 SHC7901中提取细胞总 RNA,反转录合成 cDNA,再用PCR 方法扩增目的基因序列,PCR 产物经 DNA 序列测定证实后,利用引物5端引入的 EcoRⅠ,Xba Ⅰ酶切位点,通过粘端连接,将所获目的基因分别按正、反两个方向定向克隆入真核表达载体 pcDNA3.1中,对两种重组质粒分别进行相应的酶切鉴定,采用脂质体介导的方法用 COX-2反义核酸转染 SGC7901细胞,经 G418筛选后,随机挑选细胞克隆,通过 RT-PCR 检测COX-2 mRNA 水平的变化。结果应用 RT-PCR 反应扩增获得大小约1.9kb 的特异性片段,经 DNA 序列分析,证实与文献报道的 hCOX-2编码区序列一致,重组正义表达载体 pcDNA3.1/hCOX2(+)用 EcoRⅠ,Xba Ⅰ双酶切后,产生大小约5.4kb,1.9kb 的片段;重组反义表达载体 pcDNA3.1/hCOX2(-)通过 PstⅠ酶切,产生大小约4.5kb,1.5kb 与1.3kb 的片段,与预期结果相符,转染细胞经筛选后,随机挑选、扩增了3个细胞克隆,其中1个克隆稳定表达 COX-2反义核酸,RT-PCR 提示其 COX-2 mRNA 水平显著下降.结论成功克隆了 hCOX-2编码基因序列,并构建了其正、反义真核表达载体.反转录 PCR 是克隆基因的简便、有效方法.为扩增高 GC 含量的 cDNA 模板,可在 PCR 反应体系中加入适量的 DMSO,并采用较高退火温度.在 PCR 引物中加入限制性内切酶位点,可以方便地实现基因的定向克隆.COX-2反义核酸在胃癌细胞系 SGC7901中得到稳定转染,转染细胞 COX-2mRNA 表达显著受抑制.

转反义LeETR1基因番茄采后生理特性的研究

转反义LeETR1乙烯受体基因番茄的采后生理性状与普通番茄不同。转基因番茄的呼吸作用受到抑制 ,呼吸高峰只有对照的 5 2 % ,乙烯释放高峰的出现比对照果实推迟 10d。转基因番茄的叶绿素降解和番茄红素的合成受到显著抑制 ,果实不能形成正常的红色。在成熟过程中 ,转基因番茄的纤维素酶、多聚半乳糖醛酸酶活性显著低于对照 ,延缓了果肉的软化。

转反义PG基因番茄果实细胞结构变化的研究

经细胞学观察发现 ,转反义PG基因番茄果实在不同成熟期及存放前后 ,其果皮外面几层细胞的厚度都比未转基因的厚 1～ 5 μm ,细胞结构、细胞质和细胞核等的状态都有明显区别。尤以贮存后更为明显 ,未转基因果实的果皮细胞结构解体、细胞质凝聚、细胞核变的模糊程度都比转基因的严重。经外源乙烯处理后 ,转基因和未转基因果实的细胞结构也有相似的变化。结果表明 :反义PG基因的转入降低了PG活性 ,并且减弱了外源乙烯的作用 ,延缓了果实的衰老 ,提高了耐贮性能 。

反义血管内皮生长因子基因转染治疗喉癌的实验研究

目的 观察反义血管内皮生长因子 (vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)基因转染对喉癌生长的影响。方法 克隆人VEGF基因 ,将VEGF 互补DNA(complementaryDNA ,cDNA)反向克隆到真核表达载体pcDNA3,构建反义 (以负号表示 )VEGF表达载体pcDNA3 VEGF(- ) ;利用阳离子脂质体作为载体 ,转染人喉癌Hep 2细胞 ;将转染细胞注入裸鼠皮下 ,观察肿瘤生长情况 ;将质粒pcDNA3 VEGF(- )和脂质体混合物直接注入荷瘤 (Hep 2 )裸鼠体内 ,观察肿瘤生长情况 ,通过逆转录聚合酶链反应 (reversetranscriptasepolymerasechainreaction ,RT PCR) ,观察肿瘤组织中VEGFmRNA的表达情况 ,并在透射电镜下观察荷瘤肿瘤超微结构的改变。结果 成功克隆了人VEGF基因 ,并构建了携带反义VEGF基因的真核表达载体pcDNA3 VEGF(- ) ;将其稳定转染人Hep 2细胞 ,获得了稳定表达反义VEGF的细胞系 ;将转染细胞注入裸鼠皮下 ,与对照组相比 ,肿瘤的生长速度明显减缓 ;将pcDNA3 VEGF(- )与脂质体混合物分次注入荷瘤裸鼠体内 ,肿瘤的生长较对照组明显减缓 ;在透射电镜下 ,见荷瘤肿瘤内出现大量凋亡细胞 ,肿瘤组织内毛细血管管壁变薄、不规则 ;反义VEGF质粒治疗组肿瘤组织中VEGFmRNA表达显著低于对照组。

脂质体转染反义脱氧寡核苷酸对K562细胞α珠蛋白基因表达及细胞增殖的影响

本研究查明脂质体转染反义脱氧寡核苷酸(ASON)对K562细胞α珠蛋白基因表达的抑制作用及对细胞增殖的影响,探讨基因调控治疗β地中海贫血的新思路。设计合成靶向α珠蛋白基因的ASON,并与正义寡核苷酸(SON)和空白对照进行比较。采用脂质体转染技术将ASON、SON与K562细胞共同培养,用荧光显微术、流式细胞术检测脂质体转染效率,用实时荧光定量RT-PCR法检测K562细胞中α珠蛋白基因表达情况,并通过Cell Counting Kit-8(CCK-8)法观察脂质体转染ASON技术对细胞增殖的影响。结果表明:脂质体转染效率在ASON作用24h达到最高,脂质体转染ASON组的α珠蛋白基因表达水平显著低于SON和空白对照组(p<0.01),并对细胞的增殖有明显的抑制作用,上述效应呈浓度依赖性。结论:脂质体转染ASON能特异性的抑制K562细胞中α珠蛋白基因表达,可能会成为β地中海贫血基因治疗的一个新靶点。

打点杂交及RNA酶保护分析法检测反义HSP90基因转染细胞中反义RNA的表达

目的：检测HSP90反义核酸转染细胞后反义RNA的表达。方法：采用打点杂交及RNA酶保护分析法。结果：HSP90反义核酸转染细胞AH－SGC7901，AH-SGC7901／VCR，AH－HCC7402及AH－Ec109有HSP90反义RNA的表达。结论：HSP90反义RNA在AH－SGC7901，AH－SGC7901／VCR，AH－HCC7402及AH－Ec109细胞的表达，为进一步研究HSP90在细胞生物学中的作用建立了可靠的细胞模型。

反义IGF-I基因转染人肝癌细胞分泌CEA和AFP水平的研究

本研究利用基因治疗方法中的反义RNA技术，通过脂质体包裹反义胰岛素样生长因子－I（IGF－I）基因导入人HepG2肝癌细胞株，NorthernBlot分析显示反义IGF－IRNA表达阳性。研究反义IGF－I基因转染的HePG2细胞分泌CEA和AFP的水平，放射性同位素的测定结果表明细胞培养上清中的CEA的水平显著地低于亲本细胞（P＜0．05），而分泌AFP的水平更显著地低于亲本细胞（P＜0．01）。预示着阳性克隆细胞的恶性程度低于亲本细胞，细胞内原有的生物学过程发生改变。

反义人钙周期素结合蛋白编码基因转染对胃癌细胞多药耐药性的影响

目的 研究hCacyBP编码基因在胃癌多药耐药机制中的作用。方法 采用Northern杂交 ,检测SGC790 1细胞及SGC790 1/ADR细胞中hCacyBPmRNA表达水平的差异。将hCacyBPcDNA克隆到 pcDNA3.1中 ,构建反义核酸真核表达载体 pcDNA3.1/hCacyBP ,并转染耐阿霉素人胃癌细胞 ,用RT PCR检测转染细胞中hCacyBPmRNA水平的变化。用MTT比色法和FCM ,分别检测SGC790 1/ADR细胞、pcDNA3.1/hCacyBP 和 pcDNA3.1分别转染的SGC790 1/ADR细胞 ,对ADR的药物敏感性和胞内ADR的蓄积浓度。结果 Northern杂交证实 ,SGC790 1/ADR细胞中hCacyBPmRNA表达的水平显著高于SGC790 1细胞。成功地构建了pcDNA3.1/hCacyBP 。以 pcDNA3.1/hCacyBP 转染的SGC790 1/ADR细胞中hCacyBPmRNA的表达水平 ,显著低于空载体转染及未转染的SGC790 1/ADR细胞。MTT检测表明 ,转染pcDNA3.1/hCacyBP 的细胞 ,对ADR的药物敏性较空载体转染及未转染的SGC790 1/ADR细胞有所增高 ,生存率较后两者为低。FCM显示 ,转染 pcD NA3.1/hCacyBP 的SGC790 1/ADR细胞、转染 pcDNA3.1及未转染的SGC790 1/ADR细胞内ADR的蓄积浓度 ,分别为6 .72、5 .6 2和 5 .5 4。结论 hCacyBP碥码基因对胃癌细胞的MDR有一定的影响 。

PIN1反义基因转染抑制人骨肉瘤细胞的增殖

目的观察以pIRES2-EGFP质粒为载体的PIN1反义基因转染对人骨肉瘤细胞增殖的抑制作用。方法不同量(0、20、50、100、200、250μL)的PIN1反义基因以pIRES2-EGFP质粒为载体包装后转染人骨肉瘤MG-63细胞,收集转染前后的培养细胞和上清液,MTT法观测转染前后细胞生长曲线;流式细胞仪观测细胞生长周期变化和细胞凋亡情况;Western blot法检测PIN1蛋白的表达变化;逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测PIN1mRNA表达变化。结果MTT法和流式细胞仪检测显示反义PIN1基因转染后,MG-63细胞生长受到抑制,且其凋亡被促进;Western blot结果表明转染反义PIN1基因的量越多,其PIN1蛋白表达量越低,测得空白对照组及不同量转染组的光密度比值分别为0.854±0.136、0.866±0.138、0.732±0.154、0.611±0.121、0.547±0.109、0.398±0.113、0.320±0.151,差异有显著性(P<0.05);RT-PCR检测其光密度比值分别为0.983±0.125、0.988±0.127、0.915±0.157、0.786±0.125、0.608±0.124、0.433±0.130、0.410±0.158,差异有显著性(P<0.05)。结论反义PIN1基因可封闭PIN1mRNA,使MG-63细胞表达的PIN1蛋白减少,从而抑制人骨肉瘤MG-63细胞增殖。

外源性反义血管内皮生长因子-C基因稳定转染对人胃癌细胞SGC-7901体外生长的影响

目的:观察以pCI-neo为载体的血管内皮生长因子-C(Vascular endothelial growth factor-C,VEGF-C)反义基因转染的人胃癌细胞SGC-7901中VEGF-C蛋白的表达,并研究其对人胃癌细胞体外生长的影响。方法:应用重组质粒pCI-neo-anti VEGF-C和pCI-neo空载体质粒,以脂质体转染法转染体外培养的人胃癌细胞株,以未转染组为对照,经G418筛选抗性克隆,扩大培养后,再用免疫组化和Western-blot分析VEGF-C基因及蛋白的表达,最后用MTT法分析其对细胞生长的抑制作用。结果:免疫组化和Western-blot均显示pCI-neo-anti VEGF-C转染组无VEGF-C mRNA及其蛋白的表达,MTT检测表明pCI-neo-anti VEGF-C转染组活细胞数较其它各组均低(P<0.05)。结论:pCI-neo-anti VEGF-C成功转染人胃癌细胞SGC-7901且可封闭VEGF-C mRNA,使已转染pCI-neo-anti VEGF-C的人胃癌细胞VEGF-C蛋白的表达减少,并能抑制胃癌细胞SGC-7901的体外生长,为进一步研究VEGF-C的生物学功能及胃癌的基因治疗研究创造了条件。

反义转化生长因子β1基因逆转的骨肉瘤细胞对肿瘤侵袭和转移的预防意义(英文)

背景:转化生长因子β1(transforminggrowthfactorβ1,TGFβ1)能通过自分泌和旁分泌机制促进肿瘤细胞的生长,最近有研究表明反义TGFβ1基因转染骨肉瘤细胞后可以降低肿瘤细胞的增殖活性。目的:观察反义TGFβ1基因对骨肉瘤细胞恶性表型的逆转作用,探讨其预防骨肉瘤的发生、发展的意义。设计:完全随机设计,对照实验研究。地点和材料:研究地点为华中科技大学同济医学院附属协和医院骨科实验室。TaqDNA聚合酶、TRIzolTM试剂、SuperscriptPreamplificationSystem、胎牛血清、DMEM培养基、Lipofectamine、无血清培养基、G418、PCR引物、反义TGFβ1表达质粒pcDNA3-TGFβ1(-)、人骨肉瘤细胞系MG-63、Balb/c裸鼠、流式细胞仪、CO2培养箱、相差显微镜。方法:将反义TGFβ1基因转染骨肉瘤细胞MG-63后,检测细胞周期、细胞凋亡和明胶酶A表达,并观察转染细胞软琼脂克隆形成数和裸鼠体内致瘤能力。主要观察指标:细胞周期和细胞凋亡检测;RT-PCR检测MMP-2基因表达;软琼脂培养克隆形成实验;裸鼠体内成瘤性的检测。结果:与MG-63和空载体转染细胞MG-pcDNA3相比,反义基因转染细胞MG-TGFβ1(-)的G0/G1期细胞从56.2%和60.1%增至71.6%,S期细胞从19.1%和17.8%降至12.9%,MMP-2mRNA表达明显减少。MG-TGFβ1(-)的软琼脂克隆形成数从48.

反义VEGF基因转染对HEP-2细胞生物学行为的影响

目的观察反义VEGF基因转染对HEP-2细胞生物学行为的影响。方法克隆人VEGF基因,将VEGF-cDNA反向克隆到真核表达载体pcDNA3,构建反义VEGF表达载体pcDNA3-VEGF(-);利用阳离子脂质体载体,稳定转染人喉癌Hep-2细胞,并通过流式细胞仪检测,观察转染细胞细胞周期的改变,在透射电镜下观察转染细胞超微结构的改变;将转染细胞注入裸鼠皮下,观察肿瘤生长情况。结果成功克隆了人VEGF基因,并构建了携带反义VEGF基因的真核表达载体pcDNA3-VEGF(-);将其稳定转染人喉癌Hep-2细胞,获得了稳定表达反义VEGF的细胞系,与正常Hep-2细胞相比,该细胞系细胞周期及超微结构均无明显改变;将转染细胞注入裸鼠皮下,与对照组相比,肿瘤的生长速度明显减缓。结论反义VEGF基因转染可以有效地抑制喉癌的生长。

ODC反义RNA转染细胞的肿瘤相关基因表达及其致瘤性

鸟氨酸脱羧酶(ODC)是多胺生物合成途径中的限速酶，其活性的异常升高和继之引起的多胺堆积与肿瘤的发生、发展及转移密切相关。我们曾自行构建人ODC反义RNA真核表达质粒，并转染人肺鳞癌细胞，观察到稳定转染细胞株的生长速度减慢；大分子生物合成受到抑制；ODC mRNA表达减少和ODC活性降低等。

c-fos反义基因转染对缺氧复合烧伤血清处理大鼠心肌细胞保护作用的实验研究

目的 探讨c fos反义基因转染对缺氧复合烧伤血清处理心肌细胞的保护作用。方法 烧伤血清采自 3 0 %TBSAⅢ度烫伤Wistar大鼠 ;采用含 1%O2 的混合气体作为缺氧模型 ;采用基因重组技术构建c fos反义基因重组体 ;由Li pofectaminekit介导心肌细胞转染 ;于缺氧复合烧伤血清处理 1,3 ,7h不同时相点采用RT PCR检测c fosmRNA的表达变化 ,采用Westernblot检测c fos蛋白 ,肌钙蛋白 T(TnT)和 β 微管蛋白 ( β Tubulin)的表达变化。 结果 加入烧伤血清并造成缺氧的非转染心肌细胞 (下文称非转染组 ) ,c fosmRNA和蛋白显著表达 ,3h达到最高峰 ,与正常对照组比较 ,TnT和 β Tu bulin表达显著下降 ,7h降至最低水平 ;转染c fos反义基因重组体 (下文称转染组 )后 ,c fosmRNA和蛋白表达显著下降 ,TnT和 β Tubulin表达却显著回升。 结论 缺氧复合烧伤血清处理产生的c fos会引起心肌细胞损伤 ,c fos反义基因重组体转染对缺氧复合烧伤血清处理心肌细胞具有保护作用。

BTEB2反义基因转染对大鼠颈动脉球囊损伤后内皮修复的影响

目的构建反义基本转录元件结合蛋白2(BTEB2)重组腺病毒载体,并研究BTEB2反义RNA对动脉损伤后内皮修复的影响。方法通过RTPCR从培养的大鼠血管平滑肌细胞(VSMC)中制备BTEB2cDNA,将其反向克隆至腺病毒载体,构建反义BTEB2重组腺病毒;用重组腺病毒局部转染球囊损伤的大鼠颈动脉,观察反义BTEB2基因转染对BTEB2蛋白表达及损伤内皮修复的影响。结果构建的BTEB2反义重组腺病毒经鉴定正确,其滴度为5×1010pfumL;反义BTEB2重组腺病毒转染可显著抑制BTEB2蛋白表达,明显促进内皮的修复,改善损伤动脉的内皮依赖性舒张功能。结论成功构建了反义BTEB2重组腺病毒载体。BTEB2反义基因转染可显著促进大鼠颈动脉球囊损伤后的内皮修复。

反义T-STAR基因转染降低肺腺癌A549细胞端粒酶活性

目的 通过反义技术抑制肺腺癌A5 49细胞T STAR (testes signaltransductionandactivatorofRNA)基因内源性表达,观察对细胞端粒酶活性的影响。方法 用阳性脂质体法将T STAR反义基因转染入A5 49细胞,用RT PCR及Westernblot方法检测转染细胞内源性T STAR基因mRNA和蛋白表达水平,并用PCR ELISA法检测细胞端粒酶活性改变。结果 反义基因可在mRNA及蛋白水平有效抑制肺腺癌A5 49T STAR基因的表达,同时明显降低细胞端粒酶活性。结论 肺腺癌A5 49细胞T STAR基因表达的抑制可能下调端粒酶活性。

反义MBD1基因真核表达载体转染对人胆管癌细胞MBD1基因表达的影响

目的探讨反义MBD 1基因真核表达载体转染对人胆管癌QBC-9 3 9细胞中MBD 1基因表达的影响,为进一步研究该基因的作用提供依据。方法构建反义MBD 1基因真核表达载体,通过脂质体转染入人胆管癌细胞株QBC-9 3 9中,以G 4 1 8进行筛选得到稳定转染细胞株,用PCR鉴定外源性neoR基因在转染细胞中的表达以确定转染成功。半定量RT-PCR观察转染前后MBD 1基因mRNA水平的变化,流式细胞术检测转染前后MBD 1蛋白的变化。结果人胆管癌QBC-9 3 9细胞中MBD 1基因的mRNA水平从0.9 1 2±0.0 2 2降低至0.2 1 5±0.0 1 7,转染前后的差异有显著性(P<0.01);MBD 1蛋白水平从(8 0.1 9±5.0 5)%降低到(3 5.1 1±4.0 5)%,转染前后的差异有显著性(P<0.01)。结论反义MBD 1基因转染能降低人胆管癌QBC-9 3 9细胞中MBD 1基因的表达水平,提示MBD 1基因在胆管癌的发生发展中具有重要作用,反义MBD 1基因转染有可能成为胆管癌治疗的一种新方法。

RPL23编码基因的克隆及其正反义核酸转染胃癌细胞

目的 扩增人核糖体蛋白 L 2 3(RPL 2 3)编码基因序列 ,构建其正、反义真核表达载体 ,分别转染胃癌细胞SGC790 1及胃癌长春新碱耐药细胞 SGC790 1 /VCR,以进一步研究 RPL2 3基因与胃癌多药耐药的关系 .方法 按文献报道的 RPL 2 3核苷酸序列设计合成 PCR引物 ,利用总 RNA抽取试剂盒从人胃癌长春新碱耐药细胞 SGC790 1 /VCR中提取细胞总 RNA,反转录合成 c DNA,再用 PCR方法扩增目的基因序列 .PCR产物经 DNA序列测定证实后 ,通过双酶切 ,将所获目的基因分别按正、反两个方向定向克隆入真核表达载体 pc DNA3.1 (+)中 ,酶切电泳鉴定 .采用脂质体介导的方法将 pc DNA3.1 (+) - RPL 2 3转染 SGC790 1细胞 ,pc DNA3.1(+) - an RPL2 3转染 SGC790 1 /VCR细胞 ,经 G41 8筛选后 ,随机挑选细胞克隆 .通过斑点杂交检测正、反义转染后 RPL2 3m RNA表达水平的变化 .结果 应用 RT- PCR反应扩增获得大小约 0 .5 kb的特异性片段 .经 DNA序列分析 ,证实与文献报道的人 RPL2 3编码区序列一致 .重组正义真核表达载体 pc DNA3.1 (+) - RPL2 3双酶切产生大小约 5.4kb,0 .5kb的片段 ;重组反义真核表达载体 pc DNA3.1 (+) - an RPL2 3双酶切产生大小约 5.4kb,0 .5kb的片段 ,均与预期结果相符 .转染细胞经筛选后 ,随机挑选 。

人肝素酶基因正反义荧光真核表达载体的构建及肺癌细胞转染

目的 :构建正义和反义人肝素酶与绿色荧光蛋白真核共表达载体 ,并分别转染人低转移肺癌细胞株 95C及高转移细胞株 95D .方法 :采用基因重组技术 ,用EcoRⅠ从pcD NA3 Hpa质粒上切下约 1 .7kb的人肝素酶全长cDNA片段 ,然后连入pIRES2 EGFP质粒的EcoRⅠ酶切位点上 ,经BamHⅠ酶切鉴定出正义和反义表达载体 ,并用脂质体法将肝素酶正义真核表达载体转入人低转移肺癌细胞株 95C、反义真核表达载体转入人高转移肺癌细胞株 95D ,G4 1 8筛选后 ,荧光倒置显微镜检测转染结果 .结果 :经BamHⅠ酶切后 ,正义质粒形成 5 .3+1 .7kb两条DNA片段 ,而反义重组质粒为 6 .5和 0 .5kb两条DNA片段 ,与理论计算值完全一致 ;转染后肺癌细胞倒置荧光显微下呈绿色荧光 .结论 :成功构建了人肝素酶的正、反义真核表达载体 ,并成功转染人低、高转移肺癌细胞株 ,为进一步研究正。