转基因(Cry1Ac)抗虫棉对土壤微生物的影响

对不同种植年限的转基因(Cry1Ac)抗虫棉田土壤中主要微生物数量变化进行了测定,结果表明:(1)种植转基因抗虫棉后对土壤微生物细菌、放线菌和真菌数量的影响趋势基本相似;(2)种植抗虫棉1年后,土壤中细菌、放线菌、真菌数量将有所增加,连续4年达到高峰,然后数量开始下降,连续种植7年后,棉田微生物数量接近于种植1年的棉田;(3)种植1年后又种植非转基因棉花的棉田,土壤微生物数量低于种植1年抗虫棉的棉田,与种植非转基因棉的数量无明显差异。由此可见,种植转基因抗虫棉对土壤微生物数量有一定的影响。

过量表达棉花GhSAP1提高转基因烟草的耐盐性

【目的】SAP(stress-associated protein)是一类涉及胁迫应答和调控的锌指蛋白。克隆并分析其对逆境胁迫应答的反应,为棉花抗逆育种提供候选基因。【方法】通过电子克隆方法并经RT-PCR验证获得棉花锌指蛋白基因GhSAP1,将带有目的基因的载体质粒通过PEG介导转化棉花叶肉原生质体细胞,瞬时表达分析其编码蛋白的特性及亚细胞定位信息。通过qRT-PCR技术分析目标基因的组织表达特征及非生物胁迫条件下的表达特性。通过农杆菌介导叶盘转化法,经组织培养获得转基因烟草进行异位表达,检测其与抗逆相关的生理指标,证明其提高植物抗逆能力。【结果】GhSAP1 ORF长度为543 bp,编码一条含180个氨基酸残基的多肽。其理论等电点8.97,分子量19.3 kD,具有典型的A20/AN1锌指结构域。亚细胞定位显示该基因编码的蛋白定位于细胞核上。不同组织器官表达分析显示,GhSAP1在根、茎、叶中的表达量高,而在开花后5 d的胚珠中表达量很低。GhSAP1受盐胁迫诱导,高盐处理2 h后表达量最高。利用含100μg·mL-1 Kan的培养基进行抗性筛选转基因后代,结合目标基因的PCR与RT-PCR验证,获得转GhSAP1的转基因烟草阳性株系10个。目标基因GhSAP1均能在烟草基因组中整合并异位过量表达。随机选择3个转基因烟草株系,盐胁迫处理显示,发芽一周的种子在含200 mmol·L-1 NaCl培养基上胁迫12 d,转基因植株幼苗平均成活率为81.7%,比非转基因对照植株增加近3倍,其平均根长为3.05cm,极显著高于非转基因对照。利用GhSAP1表达较高的L2纯系进行成株期烟草盐胁迫处理30 d,转基因烟草后代的SOD活性和可溶性总糖含量增幅分别为23.89 U·g-1 FW和8.37%,均显著高于非转基因对照;与未胁迫处理相比,转基因植株的叶绿素含量降低幅度仅为0.17 mg·g-1 FW,而非转基因对照降低了0.39 mg·g-1 FW;盐胁迫处理后,转基因植株的MDA含量增幅为7.42 nmol·g-1FW,而非转基因对照增幅达20.85 nmol·g-1FW;在盐胁迫下,转基因植株具有更强的K+根部运输到植株绿色组织能力,其地上部的K+/Na+为1.23,显著高于非转基因对照。【结论】GhSAP1在参与植物的逆境应答反应机制中具有重要作用,过量表达GhSAP1可显著提高转基因烟草的耐盐能力。

转Bt-cry1Ac基因棉花叶片中杀虫蛋白在环境中的降解动态

采用ELISA 方法研究了Bt 棉花叶片中Cry1Ac 杀虫蛋白在不同环境条件空气介质中和土壤介质中的降解规律。结果表明,不同环境下Bt 杀虫蛋白降解趋势有明显差异。不同温湿度及光照条件的空气介质中,Bt 杀虫蛋白的降解速度一般在初期较快,经过短暂的缓慢降解阶段后进入相对稳定状态(含量50 ng·g-1左右)。高温低湿条件下,Bt 杀虫蛋白降解较快,达到稳定水平的时间短。Bt 杀虫蛋白在光照和非光照环境下的的降解动态没有显著性差异。自然条件下Cry1Ac 蛋白在土壤介质中初始阶段降解迅速,30 d 后降解了85%左右。随着冬季的到来,杀虫蛋白降解趋于缓慢。次年春天后,杀虫蛋白的降解加快,至4 月下旬检测不到Bt 杀虫蛋白。

转Bt-Cry1Ac基因棉花对烟粉虱体内几种酶活力的影响

为研究转Bt基因棉花上烟粉虱种群较常规棉上升的原因是否受到Bt毒蛋白的影响,以及是否与体内保护酶和解毒酶活力变化有关,应用转Bt基因棉花‘新棉33B’及其常规棉受体‘33’为试验对象,采用ELISA法和酶活力测定法,分别研究了取食转Bt基因棉花后烟粉虱体内Bt毒蛋白含量以及体内过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)3种保护酶和乙酰胆碱酯酶(AChE)、羧酸酯酶(CarE)和谷胱甘肽-S-转移酶(GSTs)3种解毒酶活力的变化情况。结果表明,在取食转Bt基因棉花‘新棉33B’4 h后,烟粉虱体内能检测到Cry1Ac蛋白,并且在12 h后维持在一个相对稳定的状态。取食‘新棉33B’后烟粉虱体内的SOD和GSTs活力受到显著抑制(P<0.05),并且随着取食时间的延长,SOD活力逐渐下降,其中取食8 h、12 h、24 h和36 h后较取食‘33’的对照分别下降了37.8%、32.1%、32.0%和31.9%。CAT、POD和CarE活力显著提高(P<0.05),并且随着取食时间的延长,酶活力逐渐上升,与对照相比,取食12 h、24 h和36 h后,CAT活力分别为取食‘33’的对照的1.54倍、1.55倍和1.42倍;POD活力分别为取食‘33’的对照的1.59倍、1.39倍和1.53倍;CarE活力分别为取食‘33’的对照的1.32倍、1.34倍和1.39倍;取食‘新棉33B’对AChE活力没有明显影响。结果提示,转Bt-Cry1Ac基因棉花对烟粉虱保护酶活力总体起到促进作用,对解毒酶活力总体影响不大。故烟粉虱体内保护酶活力的增加可能会有益于烟粉虱种群的增长,但是否起到决定性作用还有待进一步研究确定。

农杆菌介导Cry1 Ab/Ac抗虫转基因玉米植株的获得

转基因技术的迅速发展有效地打破了物种间的遗传壁垒,从而加快了优良基因定向聚合的进程,然而遗传转化率低及转基因安全问题成为制约其进一步发展的限制因素。基于此,本研究以玉米自交系H99为材料,将Ac/Ds双元表达载体(包含抗虫Cry1 Ab/Ac基因和gfp报告基因等)通过农杆菌介导法转入由110粒玉米幼胚诱导出的愈伤组织中,获得28株抗性转基因植株。经PCR及RT-PCR的验证结果显示,其中8株为含有Cry1 Ab/Ac目的基因且该基因有效表达的阳性植株,转化效率达7%。通过农杆菌介导法所获得的玉米转基因植株为今后剔除抗生素筛选标记,从而获得安全的玉米抗虫新种质提供了遗传材料。

转cry1Ac1基因抗虫水稻和非转基因亲本的主要营养成分比较

秀水134-Bt是以秀水134为受体材料,通过根癌农杆菌介导的遗传转化方法导入抗虫基因cry1Ac1获得的转基因纯合品系。对转cry1Ac1抗虫基因水稻秀水134-Bt与其原亲本秀水134稻米的关键营养成分进行比较分析,包括对水分、脂肪、粗灰分、粗蛋白、氨基酸、脂肪酸、矿物质和维生素的测定分析等。结果表明,转基因水稻秀水134-Bt与非转基因亲本秀水134非常相似,在关键性营养成分上差异不明显。表明在水稻遗传转化操作过程中,T-DNA插入并未明显改变原亲本的上述品质性状。

转Bt Cry1Ac基因抗虫棉花外源基因漂移研究

【目的】研究转Bt Cry1Ac基因棉花外源基因漂移规律,为转基因棉花生态安全性评价提供依据。【方法】2014年在吐鲁番市和2015年在库尔勒市,利用小区试验种植转基因棉花,翌年利用卡那霉素抗性检测结合分子检测的方法检测外源基因的漂移。【结果】在距离转基因棉花小区边缘1~120 m均能检测到含有外源基因Cry1Ac。SGK321种子漂移率最大漂移率是向南方向距离转基因棉花小区边缘1 m处,漂移率为5%;GK19最大漂移率是向西方向达到了10.09%。以方向因素和距离因素建立Cry1Ac基因漂移Logistic回归预测模型,方向和距离对种子漂移都有显著影响(P<0.05),但方向和距离两个因子并不能最终决定外源基因的漂移率。【结论】转基因棉花外源基因漂移率受方向和距离的影响,但最终决定外源基因的漂移率,并不是方向和距离联合作用的结果。

转Cry1Ac+Cry2Ab基因棉花对天敌生长发育的影响

以转Cry1Ac基因棉和常规棉品种为对照,系统研究了转Cry1Ac+Cry2Ab棉花对小花蝽、龟纹瓢虫和中华草蛉生长发育的影响。结果表明,和常规棉品种相比,饲喂取食转Cry1Ac+Cry2Ab基因棉和转Cry1Ac基因棉品种叶片的棉铃虫初孵幼虫使各天敌不同龄期的生长发育历期均有所延长,前者延长的历期短,后者延长的历期长,但差异均未达显著水平。

转Cry1Ac+Cry2ab基因棉花对小地老虎生长发育的影响

测定了转Cry1Ac+Cry2ab基因棉花对小地老虎的致死作用及生长发育的影响。结果表明,与常规棉对照相比,转Cry1Ac+Cry2ab基因棉花对小地老虎幼虫具有一定程度的控制作用,但不理想;转Cry1Ac+Cry2ab基因棉花对小地老虎幼虫的生长发育有较大的影响,表现为使各虫态发育历期延长,化蛹时间和羽化时间延长,幼虫虫体质量和蛹质量减轻,化蛹率和羽化率明显降低。

转Cry1Ac+Cry2Ab基因棉花主要生化物质含量变化及其对棉田昆虫的影响

【目的】新型转基因棉花在进入大规模商业化应用前,需对其生态环境安全性进行评价;同时,经基因改造的新型转基因抗虫棉花可能影响抗虫棉的次生代谢,进而导致一些综合的生态学效应,致使棉花生理上发生改变,这也是转基因植物安全性评价研究的重要内容。【方法】比较了不同关键时期新型转Cry1Ac+Cry2Ab基因棉花与转Cry1Ac基因棉花和非转基因棉花叶片的鲜重、干重和干鲜比、主要酶[超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)和谷胱甘肽还原酶(GR)]活性、营养物质(蛋白质、氨态氮、脯氨酸和可溶性糖)和次生代谢产物(棉酚和单宁)含量的差异及其对棉田不同昆虫营养层昆虫个体总数和物种数的影响。【结果】棉花生长的蕾期、花期和花铃期,转Cry1Ac+Cry2Ab基因棉花、转Cry1Ac基因棉花和非转基因棉花叶片的鲜重、干重和干鲜比呈先升高后降低的趋势;SOD和POD活性在花铃期明显升高,CAT、APX和GR活性无显著变化;蛋白质、氨态氮含量无明显变化,脯氨酸和可溶性糖含量均表现为先升高后下降的趋势;棉酚含量在3个时期无显著变化,而单宁含量呈逐渐升高的趋势。3种棉花叶片中干物质积累、主要酶活性、营养物质和次生代谢产物含量均无显著差异;单株大铃数表现为转Cry1Ac+Cry2Ab基因棉花>转Cry1Ac基因棉花>非转基因棉花,小铃数则表现为转Cry1Ac基因棉花<Cry1Ac+Cry2Ab基因棉花<非转基因棉花;昆虫群落和害虫亚群落的昆虫个体总数均表现为转Cry1Ac+Cry2Ab基因棉田<转Cry1Ac基因棉田<非转基因棉田,天敌亚群落昆虫个体总数无显著变化;3种棉田中昆虫群落、害虫亚群落和天敌亚群落的物种数均未发生显著变化。【结论】转Cry1Ac+Cry2Ab基因棉花叶片干物质积累、产量性状、生化物质含量、酶活性在不同生长期表现不同,但上述参数在3种棉花之间无显著差异;且转Cry1Ac+Cry2Ab基因棉花具有较好的抗虫性,能有效降低棉田害虫数量。

Cry1Ab/1Ac基因在转基因玉米中的表达研究

本研究通过人工合成获得了密码子的优化Bt杀虫蛋白基因Cry1Ab/1Ac,并以草甘膦抗性基因epsps为标记基因,构建了高效表达载体pBAC174,并用基因枪法将表达载体pBAC174导入受体材料幼胚愈伤组织。对轰击后的愈伤组织进行筛选、分化和植株再生,获得40个草甘膦抗性的玉米再生植株。经PCR和Southern杂交检测表明,外源Cry1Ab/1Ac基因已经整合到玉米的基因组中。转基因植株叶片蛋白粗提物用BT-Cry1Ab/1Ac金标免疫检测试纸条检测,结果表明Bt基因在部分转基因植株后代获得了表达。本研究为进一步利用Cry1Ab/1Ac基因进行玉米抗虫育种奠定了基础。

mCry1Ac基因在抗虫转基因玉米Bt799中的表达特征

采用双抗夹心酶联免疫法(ELISA)定量检测转mCry1 Ac基因抗虫玉米Bt799在不同生育期不同植株部位的mCry1Ac蛋白含量。结果显示:mCry1 Ac基因在整个生育期玉米叶、茎、根和种子中均能表达,mCry1Ac蛋白含量为(0.82±0.10)^(15.83±1.77)μg·g-1;随着生育期和植株部位的不同,mCry1Ac蛋白含量呈现明显的时空动态变化,其中,叶、茎和根中mCry1Ac蛋白含量随转基因玉米生育期的推移均呈增加趋势,并均在完熟期达最高;在除苗期外的其他各生育期叶中mCry1Ac蛋白含量均显著高于其他植株部位,而在完熟期种子中mCry1Ac蛋白含量在各植株部位中最低,为(2.86±1.71)μg·g-1。

表面等离子共振传感器检测转基因植物中苏云金芽孢杆菌cry1Ac蛋白的方法研究

为建立表面等离子共振传感器检测转基因植物中苏云金芽孢杆菌cry1Ac蛋白的方法,根据生物分子间的相互作用,在金片表面修饰cry1Ac蛋白的特异性单克隆抗体,对不同稀释梯度的cry1Ac蛋白进行检测研究。结果表明:该方法可有效的检测到cry1Ac蛋白,检测灵敏度可达到10ng·mL-1,与cry2A蛋白及CP4-EPSPS蛋白无交叉反应。说明利用表面等离子共振方法检测cry1Ac蛋白操作简单,省时且灵敏度高,特异性强,可用于对cry1Ac蛋白的定量检测。

转Cry1Ac/1Ab基因棉花对异色瓢虫生长发育及其捕食功能的影响

【目的】为探究转Cry1Ac/1Ab基因棉花对异色瓢虫生长发育及其捕食功能的影响。【方法】以转Cry1Ac/1Ab基因棉与其亲本常规棉为实验材料,利用取食不同棉花品种叶片的棉铃虫饲喂异色瓢虫幼虫。【结果】与常规亲本棉相比,取食饲喂转基因棉花叶片的初孵棉铃虫幼虫的异色瓢虫幼虫从1龄发育至化蛹期时间延长0.77 d,但差异不显著;除1龄幼虫体重增加(0.0773 mg)外,其余各龄期幼虫体重均有所下降,但差异均不显著;异色瓢虫1、2、3、4龄幼虫对初孵棉铃虫捕食量均随棉铃虫密度的增加而增加,捕食功能反应均符合HollingⅡ圆盘方程。【结论】转Cry1Ac/1Ab基因棉花对异色瓢虫生长发育无显著影响,饲喂取食转Cry1Ac/1Ab基因棉花的棉铃虫对异色瓢虫捕食功能无显著差异。

转CarNAC1基因可提高棉花的抗旱性

以15份稳定遗传的转CarNAC1基因棉花及受体材料K62进行田间和室内试验,通过加权隶属函数法、主成分分析法及聚类分析等方法比较棉花光合指标、农艺性状、产量性状、纤维品质和生理指标的变化情况。结果表明:干旱胁迫后,转基因棉花品系气孔导度下降趋势及净光合速率显著高于受体材料K62;转基因棉花品系平均单铃重高于受体材料0.363~0.657 g;除丙二醛含量为转基因棉花品系低于受体材料K62外,转基因棉花品系的脯氨酸、可溶性糖含量及过氧化氢酶、过氧化物酶、超氧化物歧化酶活力均高于受体材料。基于农艺性状和产量性状指标主成分分析结果,将16个品系的9个指标综合为2个相互独立的综合指标,结合D值及聚类分析结果筛选出干旱胁迫后仍能保持相对较高产量的品系:ZK62-10、ZK62-6、ZK62-1。基于纤维品质指标主成分分析结果,将16个品系的7个指标综合为3个相互独立的综合指标,结合D值及聚类分析结果筛选出干旱胁迫后仍能保持相对较高纤维品质水平的品系:ZK62-6、ZK62-12、ZK62-15。可以得出以下结论:干旱胁迫下,转CarNAC1基因棉花品系的产量及品质均优于受体材料K62;转CarNAC1基因棉花品系可能通过降低气孔导度、增强渗透条件等方法提高棉花抗旱能力;筛选出综合抗旱能力最优的棉花品系ZK62-6。

转cry1 Ac/sck基因抗虫水稻对稻田寄生蜂群落影响的评价

以转cry1Ac/sck双基因抗虫水稻MSA、MSB、MSA4(对照:MH86)及其杂交稻KF6-304(对照:Ⅱ-YM86)为材料,系统地研究了转基因抗虫水稻对稻田寄生蜂群落的影响及生态安全性。结果表明:在群落水平上,转基因抗虫水稻MSA、MSB、MSA4及杂交稻KF6-304对稻田寄生蜂的物种丰富度、多样性指数、均匀性指数和优势集中性指数的总体情况与时间动态以及个体总数无明显负面影响,但在生长中期转基因稻可降低稻田寄生蜂的个体数量。按寄生蜂功能团分析,MSA与MSA4在水稻生长发育的后期初始,提高卵寄生蜂的数量,MSA、MSB、MSA4及杂交稻KF6-304显著降低以靶标害虫稻纵卷叶螟为寄主的寄生蜂功能团的个体数量,对其他寄生蜂无明显负面影响。

抗草甘膦基因aroAM12及抗虫基因Bts1m的转基因棉株

构建了一种新的植物高效表达载体pAM12 s1m ,其上携带有通过基因优化 (geneshuffling)技术获得的抗草甘膦突变基因 (aroAM12 )和抗虫人工合成重组Bt基因 (Bts1m)。aroAM12基因表达由CaMV35S启动子控制 ,Bts1m基因表达由2E 35S启动子和Ω因子控制。以棉花无菌苗下胚轴为外植体 ,采用农杆菌介导法将aroAM12和Bts1m基因导入棉花品种石远 32 1中 ,以aroAM12基因作为选择标记 ,草甘膦为选择剂直接筛选获得 5 2棵再生植株。PCR和Southernblot分析表明再生植株均整合有aroAM12基因 ,其中 38棵植株同时整合有aroAM12和Bts1m基因。Northernblot、Westernblot分析进一步证明整合到植株中的两个基因在转录和翻译水平上进行了有效表达。离体叶片草甘膦抗性和虫试实验证明 ,获得的转基因棉花对草甘膦和棉铃虫具有较强的抗性。

农杆菌介导Cry1Ac基因转化菊花

用农杆菌介导法,以茎段(节间)为外植体,将含有苏云金芽孢杆菌(Bt)毒蛋白Cry1Ac基 因的植物遗传载体导入菊花(切花菊)品种‘日本黄’中,得到126株抗性植株,PCR检测及基因组DNA 的Southern杂交分析表明Cry1Ac基因已整合到菊花总DNA中,共获得6株转基因植株。利用棉铃虫做转基 因植株的盆栽和叶片平皿试验,发现其中2株对棉铃虫具有很高抗性,校正死亡率达90%以上;1株对棉 铃虫具有高抗性,校正死亡率达80%以上;3株对棉铃虫抗性较明显,校正死亡率44.7%～60.9%。

转修饰cry1 Ac基因籼稻明恢81经花药培养获得抗虫DH系

对基因枪法获得的明恢 81转修饰的cry1Ac基因当代植株进行花药培养 ,共接种花药 2 6 0 0枚 ,获得 83份花培植株 ,其中双倍体植株 43份 ,单倍体植株 40份。PCR结果表明含有cry1Ac基因的植株 5 5份 ,花培植株群体中转基因与非转基因植株的比值为 2∶1(5 5 2 8)。进一步结合Southernblot和ELISA分析 ,于花培植株当代筛选到转基因纯合株系 36份。外源蛋白表达量上 ,花药来源于同一克隆的DH系的不同植株之间基本一致 ,最高的Cry1Ac含量达 0 2 5 %。田间抗虫性试验表明 ,经花药培养纯合获得的部分转基因纯合系植株对二化螟 (Chilosuppressalis)表现出高抗 ,而且主要农艺性状保持不变。以上结果表明水稻花药培养可以加速转基因的纯合与育种利用。

抗虫基因cry1Ab/Ac在水稻杂交转育后代中的表达效应

以转入了Bt基因cry1Ab/Ac的水稻品系TT51为供体,与10个恢复系杂交。通过分子检测,并结合田间的抗虫性观察,筛选出农艺性状良好的转基因纯合株系。抗虫基因在所有的杂交组合后代中按照孟德尔规律遗传,但是不同遗传背景下的表达量有很大差异。Cry1Ab/Ac蛋白含量维持原有水平的株系对螟虫表现出良好的抗性,蛋白含量降低的株系则受到轻微的危害。纯合株系的部分农艺性状发生变异,其程度与Cry1Ab/Ac蛋白含量有关。结果为利用杂交转育培育优良抗虫水稻提供依据。