转基因异源四倍体鲫鲤F_1的研究

采用显微注射法将含有鲤鱼 β actin基因启动子的草鱼生长激素基因“全鱼”基因pCAgcGHc转入异源四倍体鲫鲤 ,然后使其自交得到转基因异源四倍体鲫鲤F1,对 15 0日龄F1体重和体长进行检测 ,可明显看见转基因异源四倍体鲫鲤F1的生长优势 ;取F12 0尾 ,提取尾鳍基因组DNA ,采用合适的引物 ,PCR方法检测转基因异源四倍体鲫鲤F1是否含有外源生长激素基因 ,结果 15 0日龄F1阳性率达到 90 % ,且有些雄性个体可以挤出少量精液 ,而普通 15 0日龄异源四倍体鲫鲤无此现象。

异源四倍体鲫鲤、三倍体湘云鲫和它们父母本线粒体DNA12SrRNA基因遗传变异的分析

采用质粒克隆测序方法 ,获得了异源四倍体鲫鲤 5个个体、异源四倍体鲫鲤雌核发育二倍体后代 2个个体、三倍体湘云鲫 2个个体及红鲫、湘江野鲤和日本白鲫各 1个个体的线粒体DNA 12SrRNA基因的全序列。经对比发现 ,异源四倍体 5个个体共享 2种单元型 ,异源四倍体鲫鲤雌核发育二倍体后代 2个个体、三倍体湘云鲫 2个个体以及红鲫、湘江野鲤和日本白鲫各 1个个体分别共享 1种单元型。用MEGA 1 0软件分析了它们的碱基组成和核苷酸序列差异 ,用邻接法构建系统进化树。它们间的序列同源性在 95 %～ 99%之间 ,异源四倍体鲫鲤、三倍体湘云鲫和它们母本 (分别为红鲫和日本白鲫 )之间的序列同源性大于异源四倍体鲫鲤、三倍体湘云鲫和它们父本(分别为湘江野鲤和异源四倍体鲫鲤 )之间的序列同源性 ,结果表明 :异源四倍体鲫鲤和三倍体湘云鲫在线粒体DNA 12SrRNA基因上具有母性遗传特征。另一值得注意的地方是异源四倍体鲫鲤经过 9代 (F3 F11)繁殖后 ,在 5个个体中发现了 2种单元型 ,说明在四倍体基因库中存在遗传多样性 ,为四倍体基因库的繁殖。

异源四倍体鲫鲤及其原始父母本细胞周期蛋白B基因克隆与分子遗传分析

细胞周期蛋白(cyclin)B是真核细胞周期运转中调控G2期至M期转化的关键因子.本实验根据斑马鱼细胞周期蛋白B1基因的剪切方式,设计3对特异于金鱼和银鲫细胞周期蛋白B基因外显子区兼并引物,首次扩增出异源四倍体鲫鲤及其原始亲本红鲫和鲤鱼细胞周期蛋白B基因2条大小分别约为2.4kb和2.1kb的片段.测序及比对分析表明:这3种鱼的细胞周期蛋白B基因2个片段均包含8个外显子和7个内含子.内含子剪切位点符合GT-AG规则,推测细胞周期蛋白B基因2个片段可能是细胞周期蛋白B基因的2种存在形式.异源四倍体鲫鲤与其原始父母本细胞周期蛋白B基因片段序列的比较结果表明:无论是外显子区还是内含子区,异源四倍体鲫鲤与其原始亲本都具有较高的遗传相似性,在1025bp的外显子序列中相同的碱基位点数达963个,为异源四倍体鲫鲤来源于红鲫和鲤鱼提供了分子证据;同时,异源四倍体鲫鲤与其原始亲本差异碱基位点的存在又表明这一独特的多倍体物种与其原始亲本存在着进化上的变异.此外,还分别以细胞周期蛋白B基因外显子和内含子序列构建了包括异源四倍体鲫鲤及其原始父母本在内的系统进化树.结果初步表明:对于亲缘关系较近的物种,用外显子和内含子序列构建的系统进化树与传统的物种进化树一致;而对于亲缘关系较远的物种,用内含子序列构建的进化树与传统的物种进化顺序存在较大差异.

异源四倍体鲫鲤Sox9a基因保守区序列的克隆及内含子剪接位点分析

用特异于HMG box保守区的兼并引物扩增了异源四倍体鲫鲤及其原始亲本 (红鲫和鲤鱼 )的Sox基因 .异源四倍体鲫鲤的扩增产物共有 4条带 ,大小分别约为 2 0 0 ,6 0 0 ,90 0和1 90 0bp,而其原始亲本的扩增产物只有 3条带 ,且在雌雄个体中未发现性别特异扩增带 .回收雄性四倍体鱼 6 0 0bp扩增带 ,经亚克隆及测序分析得到一个新的编码 71个氨基酸残基的基因 .该基因与虹鳟鱼 (Oncorhynchusmykiss)、蟾蜍 (Xenopuslaevis)、鲤鱼 (Cyprinuscarpio)等的Sox9基因相似性达 97% ,据此命名为Atsox9a .通过计算机分析和RT PCR方法确定该基因含有内含子 ,并获得其内含子的序列和剪切位点 ,此内含子剪切位点在进化上是保守的 .

异源四倍体鲫鲤的性腺发育研究

采用组织切片技术对异源四倍体鲫鲤的性腺进行了研究。结果表明 :异源四倍体鲫鲤的性腺发育程序和普通鲤鲫鱼相似 ,可以分为 6个时期。雌雄个体都能达到性成熟 ,其中雌性个体性成熟年龄为一周年 ;雄性个体比雌性个体成熟早 ,1 5 0日龄即可达到性成熟。成熟卵巢的成熟系数为 9.2 5 %— 1 5 .6 0 % ,成熟精巢的成熟系数为 1 .6 5 %— 5 .1 9%。成熟期卵径为1 6 70 .4— 1 780 .5 μm之间 ,成熟精子头径为 2 .3— 2 .4μm。繁殖期为每年 3— 5月份。该研究证明异源四倍体鲫鲤的性腺发育是正常的 ,雌雄个体都能达到性成熟。

三倍体鲫鱼——异源四倍体鲫鲤 (♂ )×金鱼 (♀ )

利用雄性四倍体鲫鲤与雌性二倍体红色双尾金鱼交配 ,制备了 1种新型三倍体鲫鱼 ,并对Ⅰ龄三倍体鲫鱼染色体数目和组型、性腺指数和性腺结构、外形、生长速度等生物学特征进行了系统研究。结果表明 :这种三倍体鲫鱼染色体数目为 3n =15 0 ,核型公式为 33m +5 1sm +33st+33t;在繁殖季节 ,三倍体鲫鱼卵巢和精巢指数明显低于作为对照的红鲫卵巢和精巢指数 ;组织学切片表明三倍体鲫鱼的卵巢和精巢不能产生成熟的卵子和精子 ,证明它们是不育的。三倍体鲫鱼体色为青灰色 ,单尾 ,具有一些介于其父母本———异源四倍体鲫鲤和红色双尾金鱼之间的外形特征 ,如具有 1对肉眼不易观察到的短须 ,侧线鳞式为 31 6 7,背鳍为 18,体高 体长之比为 0 5 ,比湘云鲫的体高 体长之比 (0 4 1)有明显的增加。经过约 8个月的饲养 ,该三倍体鲫鱼平均重量为 35 0g,最大个体达 5 5 0g。在Ⅰ龄鱼中 ,雌性三倍体鲫鱼的个体生长速度快于雄性个体。与三倍体湘云鲫相比 ,该三倍体鲫鱼保留了生长速度快、不育等优点 ,同时新添了体高 体长比值更高、肉质更甜美的特点 ,为

异源四倍体鲫鲤的受精细胞学

异源四倍体鲫鲤的成熟卵子处于第二次减数分裂中期 ,精子通过受精孔进入卵内。精子入卵以后 ,受精孔立即被受精塞堵住。受精后 8min ,受精卵出现明显的精子星光 ,同时进入第二次减数分裂后期 ,即将排出第二极体 ;13min时 ,精子头部开始膨胀 ,趋向核化 ;18min时 ,雌雄原核均已形成 ,并向胚盘中央靠近 ;2 3min时 ,雌、雄原核开始接触 ;33min时 ,雌、雄原核完全融合成为一个合子核 ;38min时 ,受精卵开始第一次卵裂 ,5 3min后分裂形成两个子核。该研究证明异源四倍体鲫鲤和大多数二倍体鱼一样 ,具有正常的受精细胞学程序 ,受精方式为单精受精。

异源四倍体鲫鲤及其原始亲本遗传变异的微卫星标记分析

采用从鲤中分离出来的32对微卫星DNA标记,对异源四倍体鲫鲤、红鲫和野鲤的基因组DNA进行了研究.在筛选出的15对微卫星引物中,随引物不同,各等位基因数为1～8个,大小在100～420 bp之间.从3个不同群体内部的遗传相似系数来看,异源四倍体鲫鲤个体之间的遗传相似系数最大,说明异源四倍体鲫鲤群体内部的遗传变异程度最低,已经形成了一个遗传性状稳定的群体.从3个不同群体之间的遗传相似系数来看,异源四倍体鲫鲤和红鲫遗传相似系数为0.5625,和野鲤的遗传相似系数为0.5125,说明异源四倍体鲫鲤接受原始母本的遗传物质比原始父本野鲤要多一些.微卫星标记与以前报道的RAPD标记的检测结果是相似的,然而由微卫星标记获得的种群内和种群间的遗传距离均大于RAPD,说明微卫星标记比RAPD标记显示出更高的个体多态性.

异源四倍体鲫鲤成熟性腺和红细胞超微结构观察

用透射电子显微镜观察了繁殖季节异源四倍体鲫鲤成熟精巢、卵巢和血液中红细胞超微结构。成熟精巢由许多小叶组成,小叶内可观察到精原细胞、精子细胞和大量成熟二倍体精子精原细胞的细胞质内可见核糖体、内质网、线粒体和电子致密物质;支持细胞的细胞质中可见内质网和明显的可能与激素合作有关的颗粒状物质。二倍体精子由头部和尾部组成,头部内充满致密染色质,尾部中央轴丝具有典型“9+2”微管结构。成熟卵巢中Ⅳ和Ⅴ时相卵母细胞外包围着两层滤胞细胞;内层滤胞细胞伸出微绒毛深入透明带和卵黄膜内,并一直延伸到卵细胞的细胞质内,推断微绒毛具有物质和信息交流的功能。Ⅳ时相和Ⅴ时相卵母细胞内的卵黄具有两种形式,一种其外有囊泡包围,另一种外面没有。红细胞中32.43％的细胞核具有独特的哑铃状结构,超微结构显示这种哑铃状结构为细胞核的弯曲变形现象;少数红细胞核有一分为二的分裂现象,红细胞核的这些特征可作为区别四倍体鱼和二倍体鱼的重要标志。在亚显微水平证明四倍体鲫鲤具有正常的成熟精巢和卵巢,它们能够产生正常的二倍体精子和卵子,保证四倍体性能代代相传。

异源四倍体鲫鲤雌核发育后代的RAPD分析

在优化RAPD(随机扩增多态性DNA)检测条件基础上,从134个随机引物中筛选出53个扩增较好且多态性强的引物,对异源四倍体鲫鲤第1代(G1)、第2代(G2)人工诱导的雌核发育二倍体后代群体的DNA多态性及分子标记进行了分析。结果显示,53个随机引物在G1群体和G2群体中检测到的位点数分别为541、511,其中多态性位点数分别为70、52,多态位点比例分别为12.94%、10.18%。两个群体的平均遗传距离分别为0.0732、0.0464。研究表明,经过连续2代人工雌核发育,G2的遗传多样性明显减少,种质进一步纯化。还从53个随机引物的扩增谱带中找到了2个引物(S50、S223)的特异扩增谱带,可以作为第1、2代雌核发育群体间的分子遗传标记。由计算机软件程序构建的分支系统树清晰地反映了两个雌核发育群体及其个体间的相互关系。

异源四倍体鲫鲤鱼肾细胞培养的初步研究

介绍了原代和传代异源四倍体鲫鲤（4n=200）肾组织在含20％小牛血清的M199培养基中，在25～28℃，pH7．2—8．0条件下的培养．培养的异源四倍体鲫鲤肾组织细胞保持致密单层，其主要由上皮样细胞和少量成纤维样细胞组成，染色体数为整倍体，分布于188～200之间，且多数为200．

异源四倍体鲫鲤及其原始亲本的蛋白质研究

用聚丙烯酰胺梯度凝胶垂直平板电泳技术,对异源四倍体鲫鲤及其原始亲本红鲫和野鲤的血清蛋白、血红蛋白和肌肉蛋白进行了比较研究.结果表明,异源四倍体鲫鲤的蛋白质表型主要为原始双亲红鲫和野鲤的共同表达.这3种蛋白质都可以作为异源四倍体鲫鲤的分子遗传标记.

异源四倍体鲫鲤肝组织线粒体DNA的研究

用密度梯度离心和ＤＮａｓｅ Ⅰ、ＲＮａｓｅ消化法从异源四倍体鲫鲤（Ｆ８）和鲫鲤Ｆ２肝组织中提取和纯化线粒体ＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）。用９种限制性内切酶对异源四倍体鲫鲤和鲫鲤Ｆ２的ｍｔＤＮＡ进行了分析，结果表明ＸｂａⅠ和ＢｇｌⅡ两种限制性内切酶在异源四倍体鲫鲤ｍｔＤＮＡ上存在酶切位点多态性。通过凝胶电泳测得异源四倍体鲫鲤ｍｔＤＮＡ相对分子量平均约 １０．２９ × １０６道尔顿，分子大小为 １６．２０ｋｂ；鲫鲤 Ｆ２ ｍｔＤＮＡ相对分子量为 １０． １８ × １０６道尔顿，分子大小为１６．０２ｋｂ。根据单酶解和双酶解的片段数目和分子大小，构建了异源四倍体鲫鲤ｍｔＤＮＡ的７种限制性内切酶（Ｋｐｎ Ⅰ、Ｐｓｔ、ＳａｌⅠ、ＸｈｏⅠ、Ｂｇｌ Ⅱ、ＢａｍＨⅠ和 ＸｂａⅠ）酶切图谱。

异源四倍体鲫鲤及亲本ApoE的克隆及组织表达分析

载脂蛋白E(Apolipoprotein E,ApoE)作为胆固醇代谢过程中的关键因子,参与脂蛋白转运和性腺发育。为进一步了解该基因的作用,本实验克隆并测序了异源四倍体鲫鲤及其父母本ApoE基因的全长序列。异源四倍体鲫鲤、红鲫和鲤的ApoE全长分别为1393 bp、1384 bp和1396 bp,均编码281个氨基酸。序列对比表明,异源四倍体鲫鲤ApoE与父本鲤更为相似。另外有2个氨基酸位点发生了与父母本均不同的变异,证明异源四倍体鲫鲤除了有杂交特征外也产生了变异。通过Mega软件构建的哺乳动物ApoE进化树与系统分类相一致:鲤科鱼类的ApoE聚类在一起而分离于其它物种。Real time PCR分析表明,ApoE基因在3种鱼中的组织表达模式基本一致,所有组织均有表达,而在脾脏中表达最高。

新型三倍体鲫鱼—红鲫(♀)×四倍体鲫鲤(♂)

四倍体鲫鲤与二倍体红鲫交配形成了新型三倍体鲫鱼,该三倍体鲫鱼的体侧扁,近似纺锤形,体色为青灰色,无口须．它们的大部分可量比例性状和可数性状都介于父母本之间,并且一些可量比例性状超出亲本范围,体现出杂种特征．第一年养殖结果表明,把同规格三倍体鲫鱼和二倍体红鲫混养,三倍体鲫鱼生长速度比红鲫快11．11％．性腺观察结果表明三倍体鱼的性腺发育比普通二倍体鱼明显滞后,生殖细胞呈退化现象．与以前用四倍体鲫鲤和日本白鲫交配形成的三倍体湘云鲫相比,三倍体鲫鱼不但保持了生长速度快、不育的特点,而且表现出完全没有口须的鲫鱼类型的特征,这在细胞遗传和鱼类育种方面都具有重要意义．

不同倍性鲫鲤MeCP2基因分子克隆及时空表达分析

为了探寻不同倍性鱼生殖育性的表观遗传调控规律,实验基于不同倍性鲫鲤精巢的转录本信息库设计引物克隆了不同倍性鲫鲤的MeCP2基因。序列比对结果发现,在远缘杂交的过程中基因组发生了遗传重组和变异。基于序列公共部分设计引物,通过半定量PCR和实时定量PCR的方法分析了MeCP2基因在不同倍性鱼发育过程中的时空表达特征。结果还发现,MeCP2基因在所有组织中都有表达,但在脑组织中的表达量最高;纵向对比性腺的发育过程,MeCP2基因的表达量会随着性腺发育成熟而下降;横向对比不同倍性鱼的性腺发育,MeCP2基因在三倍体鱼卵巢中的表达量明显高于二倍体和四倍体鱼,但在精巢中的表达量随鱼的倍性增加而增加。研究表明,MeCP2基因的表达与不同倍性鱼的卵巢发育密切相关,这为研究鱼类生殖不育的分子机理及其在水产育种上的应用奠定了坚实的基础。

减数分裂关键基因Spo11和Mlh1在鲫鲤杂交鱼中的遗传分析

【目的】明确鲫鲤杂交鱼减数分裂关键基因(Spo11和Mlh1)的序列和表达特征,揭示异源双亲减数分裂因子在杂交品系的传代中是否存在选择压力,为解析远缘杂交跨越生殖障碍打下遗传学基础。【方法】以已形成稳定品系的鲫鲤杂交鱼为研究对象,包括红鲫(RCC)、湘江野鲤(CC)、鲫鲤杂交子代(F1)和异源四倍体鲫鲤(4nAT),通过分子克隆、序列比对及Western blotting等方法研究Spo11基因和Mlh1基因在鲫鲤杂交鱼中的遗传规律和表达特征,并分析其与原始父母本间的关系。【结果】RCC、CC、F1和4nAT的Spo11基因CDS序列绝大部分为1152 bp,仅4nAT中存在1157 bp的CDS序列;在F1和4nAT中均稳定获得2种原始亲本的独立遗传片段,且在4nAT中还检测到原始父母本重组基因片段[4n-SPO11-11-2(MT648223)],其与原始母本RCC-Spo11基因对应片段的相似性为96.2%,与原始父本CCSpo11基因对应片段的相似性为93.7%,表明Spo11基因表达模式并非完全保守性及4nAT存在遗传变异性。Mlh1基因CDS序列在鲫鲤杂交鱼中同样稳定存在,表现出稳定的杂合遗传特征,即F1和4nAT中既存在RCC-Mlh1基因CDS序列(相似性为99.5%),也存在CC-Mlh1基因CDS序列(相似性为99.4%),鲫鲤杂交鱼相应的遗传片段和原始亲本间仅存在极少的基因位点变异。Western blotting检测结果表明,SPO11蛋白和MLH1蛋白在鲫鲤杂交子代中均能正常表达。其中,4nAT的精巢中仅表达相对分子量较大的SPO11-β亚体,而F1的精巢中仅表达相对分子量较小的SPO11-α亚体。【结论】F1和4nAT能稳定杂合遗传原始亲本RCC的Spo11基因和Mlh1基因,虽然在CDS序列结构上存在少量差异,但最终都能独立表达相关蛋白,即杂交鱼形成过程中减数分裂关键基因的表达正常可为其跨越生殖障碍打下分子基础。