精子膜处理方法对精子介导的外源质粒转基因效率的影响

目的探讨超声、NaOH和溶血卵磷脂三种小鼠精子膜处理方法对转染质粒与精子共孵育后卵胞质内单精子注射（ICSI）授精，观察质粒转染的效率。方法采用上述三种方法对小鼠精子进行膜处理，通过Transgreen／PI荧光染色，观察小鼠精子质膜的完整性；通过流式细胞仪检测小鼠精子DNA的完整性；将处理后的小鼠精子与带GFP的转染质粒共孵育，再采用ICSI与促排卵后成熟小鼠卵子授精，统计各组受精率、卵裂率及荧光囊胚率，观察三种方法对小鼠精子作为质粒载体ICSI后转基因效率的影响。结果溶血卵磷脂方法处理小鼠精子膜的效果显著优于超声和NaOH组（99．2％vs94．7％％，90．9）（P〈0．05）。三种方法对小鼠精子DNA结构的损伤无显著性差异（P〉0．05），行ICSI后三组小鼠胚胎发育率差异不显著（P〉O．05），各组之间荧光胚胎的形成率无显著性差异（P〉0．05o结论三种小鼠精子膜处理方法的效率均能达到90％以上，且对小鼠精子DNA的损伤、行ICSI后小鼠胚胎的发育率和转基因效率无显著差异，因此，三种方法均可用于ICSI法小鼠转基因研究。

转基因显微注射剂量对鸡胚转基因效率和胚胎发育的影响

研究旨在探讨显微注射剂量对鸡胚孵化和转基因效率的影响。将SB转座子介导的转基因载体分别设置为20 ng、50 ng和100 ng,通过显微注射技术注射至14HH鸡胚血管,继续孵化至出雏。检测孵化第7、14和21天的鸡胚成活率,出雏率、初生体重和性腺阳性率。结果表明,50 ng剂量组鸡胚性腺阳性率明显高于其它两组,且各剂量组间绿色荧光蛋白基因表达强度差异不显著。各剂量组之间种蛋成活率、出雏率和雏鸡初生重差异均不显著(P>0.05)。本研究为鸡胚显微注射剂量优化提供参考,对提高转基因鸡制备效率具有重要意义。

提高制备转基因小鼠效率的研究

目的 提高制备转基因动物的效率。方法 着重对注射DNA的制备 ,高质量受精卵的获得 ,显微注射及胚胎移植各步骤中的主要影响因素进行了优化。结果 移植后出生的小鼠经PCR及Sonthern Blot检测 ,从最初的 146只仔鼠中检测到 2只阳性鼠 ,提高到由 34只仔鼠中检测到 10只阳性鼠 ,阳性鼠概率由 1 4%基本稳定增加到 30 %。结论 通过技术改良后 ,转基因效率得到明显提高 。

Tgf2转座子介导鲤Fst1基因元件在鲤中的转基因效率研究

卵泡抑素(follistatin,Fst)蛋白具有拮抗TGF-β超家族许多成员的功能,通过直接的蛋白结合可抑制肌肉抑制素(myostatin)的活性,从而恢复肌肉的生长,表现出增肌效应。参照鲤高通量转录组测序数据的拼接结果,筛选出鲤卵泡抑素Fst1基因的编码框(ORF)序列(全长1 260 bp,编码320个氨基酸),构建了包含金鱼Tgf2转座子左臂(220 bp)、右臂(185 bp)、斑马鱼Mylz2启动子和鲤Fst1基因ORF的供体质粒pTgf2-Mylz2-ccfst1。通过显微注射方法,并在体外合成的Tgf2转座酶5'加帽mRNA的介导下,获得了一批转鲤Fst1基因的转基因鲤。经PCR检测,转基因鲤Fst1外源基因的整合率平均为44.7%,对其中4尾转基因阳性鲤的扩增产物进行回收、克隆和测序验证,结果表明阳性鲤中均含有转基因目的片段。说明Tgf2转座子转基因系统可在鲤中实现较高的转座效率,为进一步研究卵泡抑素在鲤肌肉发育中的功能奠定了基础。

提高作物转基因效率方法研究进展

近年来,随着植物基因工程的快速发展,利用转基因技术进行育种和基因功能研究成为了一种重要研究手段。作物转基因方法经过三十年的不断发展,不管在方法上还是体系方面都取得了显著的进展。本综述主要对目前在作物上应用最广泛的农杆菌介导法和基因枪法分别从化学因素(氨基酸,乙酰丁香酮,共培养pH)和物理因素(预培养天数,菌株类型,热激和干燥,髙渗负压处理等)在提高作物转基因效率方法上进行了梳理,以及两种转基因方法都适用的外植体类型和大小,不同继代时间和基因型等方面在提高作物转基因效率方法上进行了梳理;比较了农杆菌介导法和基因枪法优缺点以及限制因素,并总结了相应策略。同时阐明了目前提高作物转基因效率方法面临的问题,展望了其未来发展方向,给作物转基因研究提供理论支撑。

中国转基因绵羊平均转基因效率56．8％

中国新疆畜牧科学院日前利用慢病毒载体转基因技术对绵羊进行转基因试验，通过基因检测发现162只新生羔羊中有92只为转基因绵羊，平均转基因效率高达56．8％。

大菱鲆两种转基因方法的比较研究

对外源基因导入大菱鲆(Scophthat musmaximus)的两种方法进行了研究,采用经过改进的电脉冲方法以及哺乳动物细胞中常用的转染法导入外源基因,并对两种方法进行比较。电脉冲最佳导入条件为:脉冲电压为300V/cm,脉冲次数为5,外源DNA质量浓度为20mg/L;转染法的最佳操作时间为受精后50min。应用上述两种方法进行批量转基因鱼实验,得到外源基因的导入率分别为20%～28%和60%～70%。实验表明利用转染试剂jetPEI处理单细胞期的大菱鲆受精卵能得到较高的孵化率及较高的转基因效率。

斑马鱼两种转基因方法的比较

对斑马鱼(Danio rerio)的两种转基因方法进行比较,分别采用显微注射和电脉冲导入法将携带有GFP报告基因的表达载体质粒导入斑马鱼受精卵,得出电脉冲最佳导入条件为最适电压125 V/cm,电阻50Ω,最佳导入时期为1-2细胞期(40-50 min),以及最佳外源基因浓度为300 ng/μL。利用两种方法均得到转GFP基因的斑马鱼,而两种方法对比的结果表明,显微注射法耗时费力,但转基因阳性率高;电脉冲法一次可以处理大批量受精卵,但转基因阳性率远低于显微注射法。

动物转基因技术研究新进展及其在牛育种上的应用

动物转基因技术已应用于生命科学的各个领域,尤其在研究基因功能、转基因动物育种(抗病育种和提高生产性能)、治疗人类疾病(生产药用蛋白、干细胞治疗和种器官移植)等方面得到了广泛的应用。本文从转基因技术的历史和发展状况入手,简要介绍了几种传统的转基因技术方法,重点综述了近几年为提高转基因效率和转基因精确调控的一些新技术。另外,本文就转基因技术在牛育种方面的研究现状,以及对转基因技术在牛新品种培育和生物制药等领域的应用和前景进行了综述。

动物转基因技术研究进展

文章对建立转基因动物的方法———显微注射法、逆转录病毒感染法、胚胎干细胞介导法、精子载体法和体细胞核移植法作了系统阐述,指出提高转基因效率的策略和转基因动物目前存在的问题,表达了基因各个构件和体内标志系统的设计应用对转基因整合与表达的影响。

转基因研究的现状

转基因研究的现状陈兰英方福德（北京医科院心血管病研究所，北京１０００３７）（北京医科院基础医学研究所，北京１００００５）关键词转基因效率，转基因表达，定点整合，基因产品转基因动物技术是本世纪八十年代初发展起来的一项生物技术。它克服了物种之间的生殖隔离...

显微注射制备转基因小鼠的优化

显微注射法是目前应用最广泛的转基因小鼠制备技术,但其效率较低,提高显微注射法制备转基因小鼠的效率有重要意义。外源DNA浓度、小鼠品系均是影响转基因小鼠制备效率的因素,但目前较多文献采用KM小鼠进行转基因小鼠制备效率的优化,对C57/BL6小鼠研究较少。本实验以C57/BL6小鼠为对象,分别进行2.5 ng/μl、5.0 ng/μl的外源DNA浓度原核注射。结果显示,2.5 ng/μl组的怀孕率、出生率、小鼠阳性率、转基因效率均显著高于5.0 ng/μl组的结果(P<0.05)。结论:通过原核注射方式获得C57/BL6转基因小鼠,注射的外源DNA浓度2.5 ng/μl效果较好。

胞质内精子注射法介导外源DNA生产转基因动物

通过胞质内精子注射法介导转基因已经成为生产转基因动物的一种有效手段。然而传统的ICSI介导法用冻融精子或Triton X-100处理的精子作为携带外源DNA的载体,经胚胎移植后生产转基因后代的效率很低,主要原因为这些处理方式在提高转染效率的同时对精子染色体造成了较大程度的损伤。最近研究者们提出了一种使用高浓度碱液对精子进行简单的预处理,高效地生产转基因后代的方法。这些精子完全失去了质膜与顶体,但仍保留有核的完整性,并且可以高效的将外源基因插入宿主基因组,比传统的精子处理方法获得了更理想的转基因动物的生产效率。

中国绵羊转基因研究获突破

中国新疆畜牧科学院日前利用慢病毒载体转基因技术对绵羊进行转基因试验，通过基因检测发现162只新生羔羊中有92只为转基因绵羊，平均转基因效率高达56．8％。

影响农杆菌介导的大豆转化效率的因素研究

本研究运用农杆菌介导的大豆子叶节转化的方法,探讨了包括基因型和抗生素在内的对大豆转基因效率有重要影响的多个因素。研究发现通过侵染4周后丛生芽报告基因表达的检测可以早期评估农杆菌的侵染效率,而侵染4周后丛生芽的出芽率刚能准确地反映大豆的再生能力。通过比较9个大豆品种的再生能力和对农杆菌EHA101的敏感性,得出对该法侵染效果最好的受体品种为黑农37;通过对转基因组培系统中广泛运用的4种抗生素组合的抑菌效果及对转化效率的影响的比较,得出最优的抗生素组合为头孢噻肟(cefotaxime)100mg/L加羧苄青霉素(carbenicillin)500mg/L。实验还发现,农杆菌侵染大豆子叶节的最佳侵染时间为30￣60min,共培养时间为3￣5d,组培筛选体系选用草丁膦代替潮霉素效果更好。

超声/微气泡SonoVue介导体内和体外基因转导的研究

目的初步探讨超声联合微气泡超声造影剂SonoVue介导体外培养细胞和体内肌肉组织基因转导的可行性,并研究不同超声波参数和基因用量与转基因效率之间的关系。方法利用不同强度和不同剂量超声波和声学造影剂SonoVue,介导人肝癌细胞株HepG2和BALB/c小鼠右侧胫前肌内增强型绿色荧光蛋白报告质粒的转导,分别直接或组织冰冻切片后在荧光显微镜下观察,并计算转导效率。结果超声联合微气泡造影剂SonoVue可介导体外培养的HepG2细胞和小鼠胫前肌内pEGFPC1基因转导,HepG2细胞以1MHz1.5W/cm2超声波基因转导效果最好;小鼠胫前肌以1MHz3W/cm2的超声波转基因效果最好。结论超声联合微气泡造影剂SonoVue可介导体外培养细胞和体内肌肉组织基因转导,1MHz超声波是转基因的理想频率。

基因转移新技术取得成功

我国首批15头转基因牛在新疆安然度过周岁生日,这标志着培育它们的一项基因转移新技术——"精子介导,人工授精"取得了成功。这是由新疆畜牧科学院和中国农业大学联合创造出来的。1995年,郭志勤等研究人员用经过特殊处理的载有人类基因的牛精子,采用"精子介导,人工授精"技术对400头母牛进行人工授精。去年,他们在母牛产下的220头牛犊中,获得15头转基因中,转基因效率为6.8%,创造了目前世界上最高的转基因效率。据了解。

谷子毛状根诱导方法的建立与优化

为建立一种快速鉴定谷子基因功能的技术体系,本研究通过比较谷子外植体、品种、乙酰丁香酮、菌液浓度和共培养时间对发根农杆菌K599介导的毛状根诱导效率的影响,发现发根农杆菌浓度在OD600为0.5、以谷子芽尖为外植体、在含有100μmol L–1乙酰丁香酮的毛状根诱导培养基上共培养3 d时,可使毛状根诱导率高达80.24%。将GFP基因进行毛状根遗传转化,通过GFP基因的PCR扩增和GFP荧光观察结果分析,发现谷子毛状根的转基因效率大于70%。利用该体系对谷子SiDVL1和SiDVL3的亚细胞定位和SiNHX2、SiCBL4和SiCBL7基因功能进行了分析和鉴定。结果表明SiDVL1和SiDVL3在谷子毛状根中的亚细胞定位与在烟草叶片中的一致;SiNHX2、SiCBL4和SiCBL7转基因谷子的存活率显著高于空载体转化谷子。说明本研究建立了一种高效快速鉴定谷子基因定位和功能的方法。