nr1h4调控转基因斑马鱼模型建立及相关研究

目的建立法尼醇X受体(FXR,基因名称nr1h4)组织特异性荧光标记转基因斑马鱼模型,为胆汁酸代谢相关药物筛选及安全预警提供可视化检测动物模型。方法在UCSC网站查找斑马鱼nr1h4基因调控序列,并利用Promoter 2.0软件对其进行优化,设计引物,利用PCR方法调取斑马鱼nr1h4调控序列,构建于pT2AL200R150G转座载体克隆位点,将pTol2-nr1h4-EGFP质粒与pCS-TP转座酶mRNA共同注入斑马鱼受精卵单细胞,筛选出在肝脏和肠道中特异性表达的荧光个体,通过遗传学筛选,建立Tg(-1.6nr1h4-EGFP)斑马鱼品系。将受精后第4天的Tg(-1.6nr1h4-EGFP)斑马鱼幼鱼随机分为空白对照组、溶媒对照组、甘氨酸-β-鼠胆酸组、奥贝胆酸组以及低、中、高浓度(10、20、40μg·mL)熊去氧胆酸组、胆宁片组、大黄酸组和芦荟大黄素组,连续给药4 d,观察各组转基因斑马鱼不同时间的荧光强度及发育情况,并对荧光强度进行分析。结果成功建立了Tg(-1.6nr1h4-EGFP)荧光标记转基因斑马鱼品系,绿色荧光于体节期开始在斑马鱼腹部表达,受精后第4天(4dpf)主要集中在肝脏和肠道表达。与空白对照组相比,甘氨酸-β-鼠胆酸组转基因斑马鱼在各给药时间的荧光表达水平均显著降低(4dpf:P<0.01;5~7dpf:P<0.0001),奥贝胆酸组在各给药时间荧光均显著增强(P<0.0001),溶媒组荧光表达水平与对照组无显著差异,表明了该模型的有效建立。与空白对照组相比,低浓度的熊去氧胆酸组和芦荟大黄素组转基因斑马鱼在给药第2~4天荧光表达水平逐渐增强(P<0.0001),中浓度的熊去氧胆酸组和芦荟大黄素组在各给药时间荧光均显著增强(P<0.0001),高浓度的芦荟大黄素组在给药第2~4天荧光逐渐增强(5~6dpf:P<0.001;7dpf:P<0.05),高浓度的熊去氧胆酸组荧光表达水平与空白组无显著差异;低浓度的胆宁片组和大黄酸组转基因斑马鱼在各给药时间的荧光表达水平与空白组无显著差异,中浓度的胆宁片组在各给药时间荧光均显著增强(4dpf和7dpf:P<0.0001;5dpf和6dpf:P<0.001),高浓度的胆宁片组在各给药时间荧光依旧显著增强(P<0.0001),中浓度的大黄酸组在给药第2~4天荧光逐渐增强(5dpf:P<0.0001;6dpf:P<0.001;7dpf:P<0.01),而高浓度的大黄酸组在给药第2~4天荧光开始减弱(P<0.0001)。结论Tg(-1.6nr1h4-EGFP)斑马鱼模型为胆汁酸药物机制研究、药物筛选和安全性评价提供了新的动物模型;低、中浓度的熊去氧胆酸,中、高浓度的胆宁片,中浓度的大黄酸和各浓度的芦荟大黄素均能够通过上调斑马鱼肝脏和肠道FXR促进胆汁酸转运,而高浓度的熊去氧胆酸对FXR无明显作用,高浓度的大黄酸抑制FXR表达。

靶向乳酸脱氢酶A(LDHA)对T细胞急性淋巴细胞白血病具有抗白血病作用

背景与目的T细胞急性淋巴细胞白血病(T-cell acute lymphoblastic leukemia,T-ALL)是急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia,ALL)中少见且具侵袭性的一种亚型。在T-ALL患者的血清中,乳酸脱氢酶A(lactate dehydrogenase A,LDHA)的活性增高。我们推测靶向LDHA可以作为改善T-ALL患者预后的一个潜在治疗策略。本研究旨在研究LDHA靶向治疗对T-ALL的抗白血病作用及其潜在的分子机制。方法用LDH抑制剂草氨酸盐处理原代T-ALL细胞系Jurkat和DU528。采用MTT、克隆形成、凋亡及细胞周期检测分析草氨酸盐对T-ALL细胞的作用。采用定量实时PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)和Western blotting检测相关的信号通路。采用活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)检测试剂盒检测分析草氨酸盐处理后的T-ALL细胞中的ROS产量。用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建了LDHA基因敲减的T-ALL转基因斑马鱼模型,采用TUNEL、Western blotting及T-ALL肿瘤进展检测分析LDHA基因敲减对T-ALL转基因斑马鱼模型的影响。结果草氨酸盐显著抑制了Jurkat和DU528的细胞增殖,诱导了细胞凋亡,同时也引起了Jurkat和DU528细胞周期G0/G1期阻滞,刺激了ROS的生成(P<0.001)。阻断LDHA显著减低了c-Myc基因及蛋白的表达,也降低了磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3′-kinase,PI3K)信号通路上的磷酸化丝氨酸/苏氨酸激酶(phos-phorylated serine/threonine kinase,AKT)和糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase 3 beta,GSK-3β)的表达。在T-ALL转基因斑马鱼中,LDHA基因敲减减缓了疾病进展,下调了c-Myc的mRNA和蛋白表达。结论靶向LDHA对T-ALL表现出抗白血病的作用,可作为一种对T-ALL的潜在的治疗策略。