应用hiTAIL-PCR扩增转基因木瓜的侧翼序列

品系特异性检测是实施转基因产品标识管理的技术保障,而获取转基因品系的侧翼序列是建立品系特异性检测方法的前提。本研究应用hi TAIL-PCR扩增两个抗病毒转基因木瓜品系的RB区侧翼序列。结果表明,海南木瓜样品为转基因木瓜品系18-2-4,送检木瓜样品为转基因木瓜品系16-0-1。与传统TAIL-PCR方法相比,hi TAIL-PCR扩增的非目标片段和小片段少,获得目标片段的成功率高,是快速扩增已知序列邻近的侧翼序列的好方法。

抗病毒转基因木瓜的分子检测

本研究测定了抗病毒转基因木瓜品系55-1、GMYK和华农1号的结构特征序列,并根据测序结果设计、合成了结构特异性检测引物,建立了55-1、GMYK和华农1号的结构特异性检测方法。为提高检测效率,将结构特异性检测引物和内源基因检测引物置于同一反应体系之中,建立了转基因木瓜品系的两重PCR检测方法。本研究建立的PCR检测体系可用于进口木瓜的检测,从中发现未经我国批准的转基因木瓜品系,为转基因产品的标识管理提供技术支持。

数字PCR和荧光定量PCR检测转基因番木瓜中外源基因拷贝数方法的建立及其应用

传统的检测转基因植物中外源基因拷贝数的方法是Southern杂交,该方法成本高、周期长,难以满足高通量检测外源基因拷贝数的育种需求,因此,本研究旨在建立快速且高通量检测转基因番木瓜中外源基因拷贝数的方法。本研究从番木瓜基因组中筛选出2个单拷贝基因Cpa03g018830和Cpa03g018770,以已知外源基因为单拷贝整合的转基因番木瓜为参照,利用数字PCR鉴定其拷贝数,进一步以其为内参基因,以番木瓜转基因育种常用的筛选标记基因NPTⅡ为外源目的基因,建立利用数字PCR和荧光定量PCR技术检测转基因番木瓜中外源基因拷贝数的方法。结果表明:Cpa03g018830和Cpa03g018770均为单拷贝基因;建立的数字PCR方法对转基因番木瓜中的外源基因拷贝数的检测准确可靠,而荧光定量PCR对转基因番木瓜中外源基因单低拷贝整合的检测准确度较高,对外源基因多拷贝整合的检测准确度则较低,因此,荧光定量PCR适合用来在大量转基因植株中初筛出单低拷贝整合的植株。本研究鉴定的单拷贝基因Cpa03g018830和Cpa03g018770可作为转基因番木瓜中外源基因拷贝数检测的内参基因,且建立的利用数字PCR和荧光定量PCR技术检测转基因番木瓜中外源基因拷贝数的方法,操作简单,速度快,适合批量检测,可为番木瓜转基因抗病育种中单低拷贝株系的选育提供新的方法。

转基因番木瓜的抗病性及分子鉴定

对T1代转番木瓜环斑病毒(PRV)复制酶(RP)突变体基因的两个番木瓜株系,进行了抗病性和分子生物学分析。结果表明,转基因番木瓜对PRV抗性达到高抗或免疫,目的基因RP遗传至转基因后代并在RNA水平表达,PCR可检测到CaMV35S启动子序列、标记基因NPTII。

转基因番木瓜“华农一号”事件特异性定性PCR检测方法的建立

以我国自主研发的转基因抗环斑病毒番木瓜"华农一号"为研究对象,应用TAIL-PCR技术,用载体中靠近右边界的Nos启动子序列设计特异引物,扩增插入的旁邻序列;根据测序结果,设计了产物长度分别为753和298 bp但均跨越转化载体和番木瓜基因组序列的2套特异引物,对"华农一号"进行检测,证明其可特异地把"华农一号"从转基因番木瓜品系中检测出来;2对引物的检测灵敏度都可以达到0.05%的标准,高于欧盟0.9%的检测要求;利用2对特异引物对"华农一号"的果肉、果皮、种子进行检测,可得到特异性良好的扩增.

采用多重PCR技术检测转基因番木瓜华农一号

为了建立针对转基因番木瓜华农一号简便、快速、高灵敏度的多重PCR技术,用DP305植物基因组试剂盒方法提取3种转基因番木瓜(Event 55-1、GM-YK和华农一号)和非转基因番木瓜(台农2号)样品DNA,以木瓜蛋白酶基因(Papain)作为内参基因,进行了单重PCR技术引物特异性验证,多重PCR方法条件摸索及引物的灵敏度确定。结果表明∶5对特异性引物(CP、35s、NPTII、Papain、RP)得到相应的不同大小单一条带,其大小分别103、166、213、281、369 bp,说明引物具有特异性;建立了检测转基因番木瓜华农一号的五重PCR检测技术,检测限为0.2 ng。

转基因番木瓜作为抗结核植物口服疫苗的初步研究

转基因植物疫苗的研制 ,可改变传统的疫苗接种方式和接种手段 ,大大降低疫苗的生产成本 ,具有广阔的应用前景。结核病的泛滥使抗结核的免疫预防急需开发新型的疫苗 ,研制抗结核的转基因植物疫苗具有重大的理论和实践意义。本文对具有良好免疫原性的结核杆菌分泌蛋白ESAT 6基因 ,进行了修饰改造 ,构建了带潮霉素选择抗性基因的植物表达载体和根癌农杆菌工程菌 ;采用叶盘法转化热带水果番木瓜 ,获得了 13株抗性植株 ,通过PCR、Southernblot和RNAdotblot分子检测 ,确认了 4株为转基因植株。番木瓜ESAT 6转基因植株的获得 ,为进一步的结核病植物口服疫苗的免疫研究和新型抗结核疫苗的研制与开发奠定了基础。

PRSV-CP转基因番木瓜表达与抗病能力关系的研究

利用ＲＮＡｄｏｔｂｌｏｔ（点杂交）和Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ（分子杂交）等技术，分析了ＰＲＳＶ－ＣＰ转基因番木瓜转录水平（ｍＲＮＡ）的表达，再通过ＲＮＡ斑点杂交和间接斑点ＥＬＩＳＡ等技术估测了ＲＮＡ、蛋白质在ＰＲＳＶ－ＣＰ转基因番木瓜中的表达量，最后通过大田攻毒试验检测了ＲＮＡ、蛋白质的表达量与抗病能力的关系。

PRV-CP-SN转基因番木瓜表达与抗病能力的研究

通过ＲＮＡ斑点杂交和酶联吸附免疫试验等技术定性地分析了ＰＲＶ－ＣＰ－ＳＮ转基因番木瓜的表达，又通过大田接种攻毒试验检验了ＰＲＶ－ＣＰ－ＳＮ转基因番木瓜的抗病能力，这为定量分析表达量和抗病能力关系研究奠定了理论的基础。

转基因番木瓜55-1的多重PCR鉴定方法研究

目的:建立对转基因番木瓜55-1进行品系鉴定的多重PCR检测方法。方法:根据番木瓜管家Papain基因和转基因番木瓜55-1品系的外源结构基因(35S-GUS)和调控基因(NOS)序列设计合成特异性检测引物。采用多重PCR技术对转基因番木瓜55-1进行品系鉴定。结果:本研究建立的多重PCR反应体系、反应参数能特异性地同时扩增转基因番木瓜55-1的管家基因Papain、外源结构基因35S-GUS和调控基因NOS序列。其中针对管家基因和外源结构基因的双重PCR检测方法的绝对检测低限为0.14 ng,其相对检测低限为0.14%;三重PCR检测方法的绝对检测低限为1.56 ng,其相对检测低限为1.56%。结论:本检测方法有较高稳定性,能快速准确地对转基因番木瓜55-1进行品系鉴定,该方法的检测灵敏度可基本上满足转基因食品标识管理定性检测的需要。

T4转基因番木瓜遗传性和果实品质分析

对T4代转基因番木瓜进行了分子生物学和果实品质分析,结果表明,筛选获得的转基因番木瓜均为转番木瓜环斑病毒(PRV)复制酶突变体基因(RP),且对PRV抗性达到了高抗或免疫,RP基因在转基因植物中能稳定遗传至后代并在RNA水平上表达.在田间种植时,转基因木瓜的生长状况普遍好于普通番木瓜,尤其在生长后期(10月以后),普通番木瓜100%发病(大规模种植时),而大部分(约91.8%)转基因植株生长良好,果实较多且表面光洁、基本上无环斑.与非转基因亲本相比,T4代转基因番木瓜的果实长度增加2.6%～5%,果实直径变小0.6%～1.5%,果肉厚度增加了12%～15%,因而果实形状与亲本相近或更好,且信用价值更高.转基因番木瓜果实中水分、蛋白质、氮、脂肪、还原性糖、维生素A、维生素C和类胡萝卜素的含量与对照都无显著性差异,即转基因番木瓜与亲本具有实质等同性,这表明转入的外源基因对番木瓜果实品质没有不良影响.

转基因番木瓜55-1品系的环介导等温扩增检测方法的建立

根据55-1的品系特异性序列设计了5套LAMP引物,筛选扩增效率高的引物。对筛选到的LAMP引物的反应温度和反应体系进行了优化,并进行了特异性、灵敏度和稳定性的实验。结果表明,该套LAMP引物的特异性和稳定性良好,灵敏度为0.05%,最快能在30 min内得到检测结果。建立的LAMP检测方法能有效地检测转基因番木瓜55-1品系,既简化了检测步骤,又缩短了检测时间,为转基因番木瓜的快速检测提供了技术支撑。

抗病毒转基因番木瓜及其安全性问题

本文对番木瓜生产上存在的病害问题、转基因番木瓜的研发、转基因番木瓜国际竞争的动态与趋势、转基因番木瓜的安全性、转基因木瓜的标识等几个方面进行综述。

PRSV—外壳蛋白基因在转基因番木瓜中的表达

用酶联免疫吸附试验（ＥｎｚｙｍｅｌｔｉｎｋｃｄＩｍｍｕｎｏｓｏｒｂｒｎｔＡｓｓａｙ ＥＬＩＳＡ）和蛋白质免疫印迹技术（ｗｅｓｔｅｒｍｂｌｏｔ）．对番木瓜环斑病毒外壳蛋白（ＰＲＳＶ－ＣＰ）基因转基因植株进行表达蛋白的检测。ＥＬＩＳＡ的结果表明，外壳蛋白基因已在转基因番木瓜中表达；ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析结果表明，外壳蛋白基因在转基因植株中的表达产物具有与天然蛋白同样的大小及相同的血清学反应。

抗病毒转基因番木瓜的实时PCR检测

番木瓜是世界上第一种大规模种植的转基因水果,多个国家和地区开展了转基因番木瓜的研究和田间试验。针对市场上可能遇到的转基因番木瓜种类,本文分析了这些转基因木瓜的外源基因结构,在外源基因的NOS启动子与植物基因组之间的侧翼序列中设计了3类转基因木瓜的4个品系(Event)的特异性实时PCR的引物/探针,建立了4种抗病毒转基因番木瓜的品系特异性实时PCR检测方法,优化了番木瓜果肉和种籽的DNA纯化方法。实验表明这些品系检测方法的特异性和灵敏度符合出入境检验检疫的要求,应用这些方法从市售的番木瓜中检出了台湾中兴大学研发的两个转基因品系。

农民获得转基因技术服务:基于广东番木瓜生产的实证研究

该转基因番木瓜是被我国第一个批准商业化生产的可以直接食用的转基因农作物,该文在对农户转基因木瓜技术采用的影响因素进行计量经济分析的基础上,提出了尽快完善转基因生物技术信息服务等政策建议。

转基因番木瓜基因组DNA的快速制备和PCR检测方法

转基因番木瓜检测中,模板DNA的制备是关键一步。为了提高检测效率,建立快速制备番木瓜样品基因组DNA和PCR检测方法十分重要。建立了番木瓜基因组DNA的快速制备方法,包括样品准备、制备缓冲液匀浆和稀释上清。在完成不同番木瓜样品的基因组DNA快速制备后,对获得的DNA进行PCR检测验证。普通PCR验证结果显示,本方法制备的叶片和果肉基因组DNA溶液稀释5倍时,PCR扩增条带清晰,更高稀释倍数时,叶片基因组DNA扩增条带强于果肉基因组DNA;实时荧光PCR验证结果显示,叶片基因组DNA的PCR扩增效率位于合理区间。灵敏度测试结果表明,含量低至0.1%的叶片和果肉样品,内标准基因和外源基因特异性片段普通PCR和实时荧光PCR均能得到预期扩增,且重复性较好。本研究建立的番木瓜基因组DNA快速制备与PCR方法效果良好,体系稳定。

转基因番木瓜pUC57-Papaya质粒标准分子的构建与适用性研究

构建了含番木瓜2个内标准基因、4个筛选靶标及3个转化体特异性片段的质粒分子pUC57-Papaya,进行了适用性验证实验。应用普通PCR和实时荧光定量PCR对其进行互换性评估;使用质粒分子对2个样品进行转基因含量测定。结果显示:质粒分子全部9个目的片段按照设计排列,序列完全一致;全部9个基因片段普通PCR和实时荧光PCR方法均能正确扩增得到预期结果,特异性、灵敏度与基因组DNA一致;全部9个基因构建标准曲线做定量测试时,与基因组DNA标准曲线斜率无显著差异,线性相关系数均大于0.99,其中内标准基因Papain、NOS终止子、YK1601与55-1事件特异性片段的截距无差异;利用质粒分子测量2个样品的Papain、NOS终止子、YK1601与55-1事件特异性片段拷贝数,计算转基因含量,结果与基因组DNA一致;测序结果显示各片段拷贝数比值为1,质粒DNA拷贝数浓度为(2.54±0.10)×10^(6)copies/μL。构建的标准质粒分子可代替基因组DNA用于定量检测,也可作为转基因番木瓜定性和定量检测用标准物质。

转基因番木瓜检测方法的建立

番木瓜(Carica papaya)是一种有较高食用和药用价值的草本果树,番木瓜蛋白酶广泛应用于医药、美容、日化品等行业[1]。番木瓜环斑花叶病毒(PRSV)是危害番木瓜生产的一种世界性病毒,植株受到侵染后,无法进行有效治疗,目前的化学杀菌剂不能有效控制其蔓延[2]。培育抗病品种是防治环斑花叶病毒最紧迫的任务之一,但番木瓜栽培品种中缺乏有效抗病基因资源[3]。

SYBR-Green实时荧光PCR检测转基因番木瓜

分别以RBCL基因和PRSV-CP基因、PRSV-RP基因为内源基因和目标基因,设计了3对特异性引物,对转基因番木瓜进行了SYBRGreen实时荧光PCR检测.结果表明,RBCL基因引物对所有供试样品成功扩增,Ct值为15～16,PRSV-CP引物对转PRSV-CP基因番木瓜样品成功扩增,Ct值为20～25,PRSV-RP引物对转PRSV-RP基因番木瓜样品成功扩增,Ct值为21～22.运用熔解曲线进行产物分析,验证了试验结果的特异性和准确性.