基于Aβ42转基因果蝇对红参多糖防治阿尔茨海默病作用及机制的研究

目的:观察红参多糖对β淀粉样蛋白(Aβ)42转基因果蝇阿尔茨海默病模型行为学的影响,并检测果蝇脑组织β淀粉样蛋白1-42(Aβ1-42)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、环腺苷酸(cAMP)及乙酰胆碱酯酶(AChE)水平,评价红参多糖对阿尔茨海默病的治疗作用并探讨其可能的作用机制。方法:正常野生型果蝇作为空白组,Aβ42转基因果蝇随机分为3组,即模型组、红参多糖组、盐酸多奈哌齐阳性对照组。8 d后比较果蝇的攀附指数、进入无障碍可食离心管果蝇的个数以及果蝇脑组织中Aβ1-42、SOD、MDA、cAMP及AChE含量。结果:攀附指数显示红参多糖组、阳性对照组均极显著高于模型组,差异均有统计学意义(均P<0.01),且红参多糖组与阳性对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05);在各时段内,红参多糖组、阳性对照组进入无障碍可食离心管果蝇个数均显著高于模型组,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。红参多糖组、阳性对照组果蝇SOD活性均显著高于模型组,差异均有统计学意义(均P<0.01),红参多糖组、阳性对照组果蝇Aβ1-42、MDA、cAMP、AChE含量均显著低于模型组,差异均有统计学意义(均P<0.01),且红参多糖组与阳性对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论:红参多糖可提高果蝇脑组织中SOD活性、降低其Aβ1-42、MDA、cAMP及AChE水平,推测红参多糖可能是通过改善Aβ沉积、抗氧化和改善神经细胞信号转导等方面,对Aβ42转基因果蝇起到较好的治疗作用,且其效果与阳性对照药相当。

三七多糖对阿尔兹海默症模型果蝇(Aβ42转基因果蝇)的影响及其机制研究

目的 测定三七多糖含量,观察三七多糖对Aβ42转基因果蝇影响,探讨三七多糖对阿尔茨海默症的治疗作用及其作用机制。方法 利用苯酚硫酸法测定三七总多糖含量;野生型果蝇为空白组、Aβ42转基因果蝇随机分为3组,即模型组、三七多糖组、阳性对照组(盐酸多奈哌齐),分别设置0.008、0.04、0.20、1.00、5.00 mg/mL5个给药浓度。检测各组果蝇攀爬能力;比较各组果蝇存活时间,包括平均寿命、半数死亡时间、最高寿命,并利用酶联免疫试剂盒测定果蝇脑组织中β-淀粉样斑块、丙二醛、环磷酸腺苷、乙酰胆碱酯酶含量及超氧化物歧化酶活性。结果 果蝇的攀爬指数在1 mg/mL前呈剂量依赖性,即随着给药浓度的升高,果蝇的攀爬指数相应升高(P<0.01),在给药浓度为1 mg/mL时,攀爬指数为85.11%达到峰值;三七多糖组果蝇的平均寿命、半数死亡时间、最高寿命均显著高于模型组(P<0.01);三七多糖组果蝇脑组织超氧化物歧化酶活性显著高于模型组(P<0.01);三七多糖组果蝇脑部Aβ-42(P<0.05)、丙二醛(P<0.01)、乙酰胆碱酯酶(P<0.05)含量均显著低于模型组。结论 三七多糖对Aβ42转基因果蝇具有较好的治疗作用,推测其治疗作用可能与改善β淀粉样蛋白沉积、抗氧化、减少乙酰胆碱水解等相关。

Hsp22对SCA3/MJD转基因果蝇的神经保护作用研究

为了探讨Hsp22在SCA3/MJD发病机制中的作用.选用GMR-GAL4和elav-GAL4驱动子,利用经典的GAL4-UAS系统,将含有78个CAG重复扩增的ataxin-3蛋白片段(MJDtr-Q78)分别在果蝇眼睛和神经系统选择性表达,构建GMR-GAL4/UAS和elav-GAL4/UAS系统SCA3/MJD转基因果蝇模型,然后利用遗传学方法和热休克反应使Hsp22在SCA3/MJD转基因果蝇眼睛和神经系统以不同水平过表达.结果表明,Hsp22过表达显著抑制了MJDtr-Q78蛋白的神经毒性,果蝇眼睛视网膜光感受神经元变性明显缓解,果蝇存活能力也显著提高.Hsp22对SCA3/MJD具有保护作用,增强Hsp22表达对SCA3/MJD可能是一种潜在的治疗方法.

Yippee转基因果蝇品系的建立及基因功能的初步研究

Yippee基因家族在真核生物中编码高度保守的锌指结合蛋白,其功能未知.利用RT-PCR(reversetranscription-polymerase chain reaction)的方法扩增出果蝇Yippee基因CDS(coding sequence),并构建了pUAS-Yippee-IRES-GFP绿色荧光过表达质粒.通过果蝇胚胎显微注射和mini-white标记基因筛选,获得了Yippee转基因果蝇品系.将该转基因品系与Hand-GAL4杂交、Yippee基因干扰品系(39898)与Hand-GFP品系杂交,在荧光显微镜下观察杂交后代幼虫的心管和淋巴腺,结果未发现心管和淋巴腺有畸形变化.果蝇Yippee基因是否与果蝇心管和淋巴腺的发育有关尚有待深入研究.

Drp1的调控对PINK1突变转基因果蝇的保护作用

帕金森病(PD)是以黑质致密部多巴胺神经元选择性减少和胞浆内路易小体的形成为特征的神经退行性疾病。研究发现,PTEN诱导激酶1(PINK1)基因突变导致家族性早发型帕金森病的发生。在转基因果蝇中,PINK1功能丢失导致间接飞行肌缺陷,线粒体结构、功能障碍,多巴胺神经元丢失。本研究在PINK1突变PD转基因果蝇中,进行发动蛋白相关蛋白1(Drp1)过表达和敲低,探索Drp1对PD转基因果蝇的保护作用及其可能机制。本研究选用MHC-Gal4/UAS系统的PD转基因果蝇模型,特异性启动PINK1B9基因于果蝇肌肉组织中表达;运用Drp1基因过表达和RNA干扰干预PINK1B9转基因果蝇,研究其对PD转基因果蝇的作用。结果显示,不论过表达Drp1还是Drp1敲低均可挽救PINK1突变转基因果蝇,降低翅膀异常率,改善飞行能力,恢复间接飞行肌排列,调节线粒体形态,提高ATP生成量,上调NDUFS3蛋白表达水平。本文结果提示,Drp1的调控挽救PINK1突变转基因果蝇与线粒体呼吸链有关。

β淀粉样蛋白对阿尔茨海默病转基因果蝇认知功能的影响

目的探讨Aβ40、Aβ42、Aβ42Arc对阿尔茨海默病(AD)转基因果蝇认知功能的影响。方法分别建立Aβ40、Aβ42、Aβ42 Arc转基因AD果蝇模型。根据实验要求将果蝇分为4组,分别是野生果蝇对照组、Aβ40组、Aβ42组、Aβ42 Arc组。在整体动物水平上进行果蝇行为学研究,分别检测各组果蝇的嗅觉短期记忆能力、攀爬能力和平均寿命。结果在巴甫洛夫嗅觉相关短期记忆测试、攀爬能力试验、平均寿命测试中,与对照组相比,3组转基因果蝇的嗅觉记忆能力、攀爬能力、平均寿命均明显降低。结论 Aβ的毒性作用会导致AD转基因果蝇认知功能下降。

阿尔茨海默病转基因果蝇模型β淀粉样蛋白对胆碱能突触的毒性影响

目的研究β淀粉样蛋白(Aβ)多肽对阿尔茨海默病(AD)转基因果蝇大脑中胆碱神能经元突触的影响。方法分别建立转Aβ40,Aβ42基因果蝇AD两个模型组,以野生果蝇(canton-s)作为对照组。采用生物素染色和激光共聚焦成像记录投射神经元的形态;通过全细胞膜片钳方法记录各组投射神经元胆碱能的自发突触后电流和微兴奋性突触后电流;检测各组果蝇的嗅觉短期记忆能力。结果与对照组相比较,Aβ42组的自发突触后电流的频率和振幅均有明显降低,差异有统计学意义(P<0.05);Aβ42组微兴奋性突触后电流的频率明显下降,差异有统计学意义(P<0.05)。在巴甫洛夫的嗅觉相关的短期学习记忆测试中,与对照组相比较,Aβ40,Aβ42两组果蝇学习记忆指数均明显降低,差异有统计学意义(P均<0.05)。结论 Aβ肽对胆碱能突触传递的影响提示,其可能是由Aβ肽引起胆碱能神经元变性和记忆不断下降的可能机制之一。

沉默信息调节因子2对SCA3/MJD转基因果蝇的神经保护作用及其与自噬的相关性研究

为探讨沉默信息调节因子2(Sir2)在SCA3/MJD发病机制中的作用.选用GMR-GAL4和Nrv2-GAL4驱动子,利用经典的GAL4-UAS系统,将含有78个CAG重复扩增的ataxin-3蛋白片段(MJDtr-Q78)分别在果蝇眼睛和运动神经元内选择性表达,构建GMR-GAL4/UAS和Nrv2-GAL4/UAS系统SCA3/MJD转基因果蝇模型,然后分别在抑制和不抑制自噬的情况下,使Sir2在SCA3/MJD转基因果蝇眼睛和运动神经元内过表达.结果发现,Sir2过表达明显抑制了SCA3/MJD转基因果蝇眼睛视网膜光感受神经元变性,显著改善了果蝇运动能力,而在自噬被抑制后,Sir2的作用效果明显减弱,表明Sir2对SCA3/MJD转基因果蝇具有神经保护作用,而这种神经保护作用需要依赖自噬的功能.

Ataxin-3(MJDtr-Q84)对PINK1(CG4523)突变帕金森转基因果蝇的保护作用

目的探讨突变型ataxin-3(MJDtr-Q84)对PINK1(CG4523)突变帕金森转基因果蝇表型的影响及其机制。方法选用MHC-GAL4肌肉启动子,运用遗传学方法,构建正常组(W1118/y; MHCGAL4/+)、PD疾病模型组(PINK1^(B9)/y; MHC-GAL4/+)、ataxin-3干预组(PINK1^(B9)/y; MJDtr-Q84/MHCGAL4),记录各组果蝇表型特征。通过电镜观察线粒体形态结构,ATP试剂盒检测各组ATP含量,应用实时荧光定量PCR技术检测ND42转录水平,蛋白免疫印迹western blot检测NDUFS3蛋白表达量。结果与正常野生型果蝇比较,PD疾病模型组果蝇翅膀发育异常,飞行能力差,线粒体形态结构改变,ATP产量降低,ND42 mRNA和NDUFS3蛋白表达量均下调。利用ataxin-3(MJDtr-Q84)干预PD组果蝇后,明显保护其翅膀形态及飞行能力,并恢复线粒体线粒体形态及功能。结论 Ataxin-3(MJDtr-Q84)对PINK1(CG4523)突变PD转基因果蝇模型具有保护作用,该保护作用与线粒体功能有关,为帕金森病的治疗提供实验基础和新的研究方向。

线粒体未折叠蛋白反应在Sir2抑制帕金森转基因果蝇中的作用

目的探讨Sir2对帕金森病(PD)转基因果蝇是否有神经保护作用及与线粒体未折叠蛋白反应(UPRmt)的相关性。方法选用Mhc-GAL4启动子,利用经典的GAL4-UAS系统构建Mhc-GAL4/UAS系统Pink1B9PD转基因果蝇模型,通过遗传干预使Sir2在Mhc-GAL4/UAS系统PD转基因果蝇运动神经元内过表达,观察Sir2过表达对果蝇运动神经元变性是否具有神经保护作用,然后通过RNAi技术抑制UPRmt相关基因热休克蛋白60(Hsp60)、GCN-2的表达,观察Sir2过表达对抑制果蝇运动神经元变性的作用,以及验证这种作用是否与UPRmt相关。结果 Sir2过表达明显抑制了PD转基因果蝇运动神经元变性,显著改善了果蝇运动能力,而在UPRmt被抑制后,Sir2的保护作用明显减弱。结论Sir2对PD转基因果蝇具有神经保护作用,而这种神经保护作用与UPRmt相关。

双拷贝APP/BACE/DPsn转基因果蝇模型的建立及基因功能的研究

阿尔茨海默症(Alzheimer's disease,AD),是一种以脑中β-淀粉样蛋白(β-amyloid peptide,Aβ)沉积为主要病理改变的神经退行性疾病。在果蝇Drosophila模型中建立淀粉样蛋白前体蛋白(amyloid precursor protein,APP)的剪切通路模拟Aβ的产生过程,有望建立一种快速筛选治疗AD药物的动物模型。我们利用经典的Gal4/UAS系统,将现有的APP/BACE/DPsn果蝇品系连续杂交,通过同源重组的方法构建表达两个拷贝的APP/BACE/DPsn稳定可遗传的转基因果蝇新品系。进一步的实验结果表明:与不表达APP/BACE/DPsn的对照果蝇w/y;APP/Cyo;BACE-DPsn/TM6BTb相比,表达两拷贝APP/BACE/DPsn的w/y;elav-APP;BACE-DPsn果蝇的最长寿命为52d,比对照组(69d)缩短了17d,为对照组果蝇的75%;中位生存时间为39d,比对照组(49d)缩短了10d,为对照组的80%;平均寿命为37d,比对照组(47d)缩短了10d,为对照组的79%。同时,表达两个拷贝APP/BACE/DPsn的果蝇所产卵的羽化时间比对照果蝇延长了3d;其羽化成虫的理论值为1∶9(11%),而实际羽化率仅为5.2%。结果提示,由elav-Gal驱动在果蝇泛神经元内过表达APP/BACE/DPsn,可以缩短果蝇寿命、干扰果蝇胚胎正常发育。该果蝇有可能作为初步筛选AD治疗药物的动物模型,为AD治疗新药的发现提供工具。

Wnt2过表达对PINK1^(B9)转基因果蝇的作用机制

目的 PINK1和Parkin基因直接参与线粒体功能形态的调节和维持。文章旨在探讨Wnt2过表达对PINK1^(B9)转基因果蝇的影响及其机制。方法利用GAL4-UAS系统构建转基因果蝇,实验分为正常对照组(W1118/+;MHC-GAL4/+)、模型组(UAS-PINK1^(B9)/y;MHC-GAL4/+)、Wnt2过表达干预组(UAS-PINK1^(B9)/y;MHC-GAL4/Wnt2OE)、Wnt2RNAi干预组(UASPINK1^(B9)/y;MHC-GAL4/Wnt2)。第5天时观察各组果蝇的异翅率(%)与飞行率(%),通过Western blot检测Ndufs3蛋白含量,用实时荧光定量PCR法检测线粒体代谢合成相关基因过氧化物酶体增殖活化受体γ共激活因子-1α(PGC-1α)、核呼吸因子1(Nrf1)、核DNA编码的线粒体转录因子A(TFAM)的mRNA表达水平,电镜观察线粒体形态,高分辨率线粒体呼吸测定系统检测ComplexⅠ、ComplexⅡ功能。结果与正常对照组比较,模型组表现出异翅率升高[(1.87±0.06)%vs(68.79±0.70)%]、飞行率降低[(97.51±0.52)%vs(3.95±0.53)%],差异均有统计学意义(P<0.05);与模型组比较,Wnt2OE干预组异翅率[(10.14±1.72)%]降低、飞行率[(41.83±2.57)%]升高(P<0.05)。与正常对照组比较,模型组中Nrf1、PGC-1ɑ基因表达水平、NDUFS3蛋白、线粒体ComplexⅠ、ComplexⅡ降低(P<0.05);与模型组比较,Wnt2OE干预组Nrf1、PGC-1ɑ、NDUFS3蛋白、ComplexⅠ、ComplexⅡ表达水平上升(P<0.05)。结论 Wnt2过表达对PINK1^(B9)转基因果蝇具有保护作用,这种作用与改善线粒体功能有关。

维生素B3对PINK1^(B9)突变转基因果蝇模型的保护作用研究

目的探讨维生素B3对PINK1B9突变转基因果蝇的保护作用及其可能机制。方法选用TH-Gal4/UAS系统的PD转基因果蝇模型,按处理方式分为正常对照组、PD转基因果蝇模型组、PD转基因果蝇模型+维生素B3干预组,PD转基因果蝇模型用GAPDH2 RNAi基因干预+维生素B3干预组,进行果蝇形态学、ATP水平、果蝇的mRNA水平和蛋白印记检测。结果适当浓度的维生素B3能部分挽救PINK1B9果蝇的飞行能力和降低翅膀异常率。并且上调了GAPDH和NDUFS3蛋白的表达,增加ATP生成的相对水平。再用GAPDH2 RNAi干预PINK1B9转基因果蝇后GAPDH和NDUFS3蛋白表达相应下降。结论维生素B3可能通过上调GAPDH和NDUFS3水平发挥调控糖酵解和氧化磷酸化起到保护作用。

管状蠕虫Ridgeia piscesae TAK1的克隆及其转基因果蝇制备

Ridgeia piscesae是唯一一种存在于东北太平洋Juan de Fuca Ridge热液区的管状蠕虫,我们成功通过RACE PCR获得Ridgeia piscesae TAK1(Rp TAK1)基因全长c DNA序列.为深入研究TAK1基因在管状蠕虫中的作用,本文通过显微注射获得Rp TAK1转基因果蝇,并在果蝇体内成功过表达Rp TAK1基因.我们发现由Rp TAK1编码的氨基酸序列具有一定保守性,可能暗示其功能上的保守性,同时也暗示TAK1蛋白在物种进化中的保守性.而过表达突变体果蝇的眼睛出现变异,包括眼睛变得粗糙、单眼排列不整齐及整体形状变小,可以看出Rp TAK1基因影响果蝇的机体发育,我们猜测在Rp TAK1基因在管状蠕虫的生长发育过程中也可能起到重要作用.

癸酸三酰甘油对β淀粉样蛋白42转基因果蝇的影响

目的观察癸酸三酰甘油(Tri)对Aβ42果蝇爬行力、脑组织超氧化物歧化酶(SOD)和ATP含量及脑组织病理的影响。方法杂交获得实验果蝇后分为5组,分别为we组(正常对照野生果蝇,予1‰DMSO食物)、ae组(Aβ42果蝇,予1‰DMSO食物)、Tri低剂量组(Aβ42果蝇,予0.03μmol/L及1‰DMSO食物)、Tri中剂量组(Aβ42果蝇,予0.3μmol/L及1‰DMSO食物)、Tri高剂量组(Aβ42果蝇,予3μmol/L及1‰DMSO食物)。记录果蝇爬行力,测试脑组织SOD、ATP含量,观察脑组织病理HE切片。结果同时间点,Tri各剂量组爬行力比ae组好转,差异有统计学意义(P<0.05),随药物浓度增加爬行力有增加趋势。Tri高剂量组SOD、ATP量较ae组明显增加(P<0.05)。Tri高剂量组与we组脑组织病理切片相似,与ae组比较明显好转。结论 Tri能改善Aβ42果蝇的爬行力,增加Aβ42果蝇SOD及ATP的含量,减少Aβ42果蝇脑组织中空泡的数量。

人源Tau蛋白截短片段转基因果蝇模型的建立

人Tau蛋白是一种主要的细胞骨架蛋白,由Tau蛋白组成的神经纤维缠结是阿尔茨海默病的两大病理特征之一,C末端缺失的Tau已经证实是神经纤维缠结的组份之一,体内体外实验已经证实,Tau蛋白可以是多种蛋白酶的水解底物。但是,Tau蛋白水解产生的截短片段在阿尔茨海默病中的作用目前还不清楚。为了能够在在体水平研究Tau蛋白截短片段的毒性机制,将Tau蛋白截短成不同的截短片段:Tau1-44、Tau45-441、Tau45-230、Tau231-441。利用显微注射的方法构建Tau基因截短片段的转基因果蝇,并利用果蝇中的UAS/GAL4系统驱动截短的Tau蛋白片段在果蝇的眼睛中异位表达,该实验结果发现在果蝇眼睛中过表达Tau蛋白截短片段并没有对果蝇眼睛的发育造成明显的毒性,从而推断Tau蛋白水解是机体的一种自我保护机制。

Hsp22保护SCA3/MJD转基因果蝇神经的机制

目的:探索Hsp22保护SCA3/MJD转基因果蝇神经的机制。方法:利用GAL4-UAS系统,使Hsp22在SCA3/MJD转基因果蝇模型的神经系统中表达。观察果蝇的羽化率,Western blot检查线粒体复合物I亚基NDUFS3的蛋白水平。结果:Hsp22诱导不能羽化的elav-GAL4/UAS系统启动的SCA3/MJD转基因果蝇部分羽化,线粒体复合物I亚基NDUFS3蛋白表达升高。结论:Hsp22可能通过改善线粒体功能对SCA3/MJD转基因果蝇神经起保护作用。

UAS-Mlp84B-GFP转基因果蝇制备及其表达分析

黑腹果蝇作为经典遗传学和分子遗传学模式生物,已经成为研究基因调控器官发育以及各种疾病发生的一个强有力的模型。为了探究Mlp84B在果蝇体内的表达定位及互作蛋白质,首先将含启动子元件的果蝇Mlp84B基因组融合GFP序列克隆至pUAST表达载体中,利用胚胎显微注射技术将构建好的重组质粒注射到果蝇早期受精卵;其次通过杂交获得红眼果蝇,经单果蝇建系、平衡子定位后获得稳定遗传的转基因果蝇;最后通过在果蝇体内检测到GFP的表达,同时经qRT-PCR检测到Mlp84B的表达水平上升,证实转基因果蝇构建成功。GFP定位结果显示,内源Mlp84B在果蝇肌肉系统表达,并且Mlp84B与Act57B在果蝇体内相互作用。实验结果表明,文中构建的UAS-Mlp84B-GFP转基因果蝇可以作为肌肉的标记品系,这为探究肌肉系统形成和稳态奠定了基础。

地黄饮子对转基因果蝇AD模型mTOR信号通路中4E结合蛋白和p70核糖体S6蛋白激酶表达的影响

目的:研究地黄饮子对转tau基因果蝇m TOR信号通路中4E结合蛋白(4E-BP)和p70核糖体S6蛋白激酶(p70S6K)表达的影响,探讨其防治AD的疗效和作用机制。方法:将果蝇分为3组,即空白组、地黄组、模型组,空白组为正常CS果蝇喂普通培养基,地黄组为转tau基因果蝇喂2%浓度地黄饮子培养基,模型组为转tau基因果蝇喂普通培养基,均喂养5d。采用荧光定量PCR技术检测果蝇4E-BP和p70S6K的m RNA表达,Western blot方法检测4E-BP和p70S6K蛋白的表达。结果:地黄饮子能够降低4E-BP和p70S6K的m RNA和蛋白的表达,且与模型组比较差异均具有统计学意义(P<0.01)。结论:地黄饮子通过调控m TOR信号通路中4E-BP和p70S6K的m RNA和蛋白的表达,调节了细胞周期,抑制了细胞的凋亡,提高转tau基因果蝇AD模型学习记忆能力。

dRaf1转基因果蝇的构建与表型分析

黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)是生物学研究中最重要的模式生物之一.首先,将dRaf1基因克隆到Gal4诱导表达的染色体定点插入载体p UAST-att B质粒后进行显微注射,成功构建了可诱导dRaf1表达的转基因果蝇.将dRaf1转基因果蝇品系与眼睛或翅膀特异性表达GMR-Gal4和Nub-Gal4品系果蝇分别杂交,观察dRaf1在果蝇或翅膀过表达的表型,确定其发育特征.其次,将翅膀中过表达dRaf1的果蝇与HpoRNAi的果蝇杂交发现,dRaf1在果蝇翅膀中的表型明显增强.本研究为大规模筛选修饰dRaf1活性与功能的调节因子奠定基础.