转基因油菜TOPAS 19/2质粒分子多家协同实验及不确定度评定

质粒分子是转基因产品核酸定量检测的一类新型标准物质,具有易制备、周期短、成本低等特点。采用实时荧光定量PCR技术,并协同7家实验室对转基因油菜TOPAS 19/2质粒分子进行了基因组的可替代性研究、协同实验研究及不确定度评定。T检验表明,质粒和基因组所产生的内源和外源基因标准曲线的斜率和线性相关系数没有显著性差异。对多家定值的数据进行了统计分析得出,TOPAS19/2质粒分子的量值结果为0.910,扩展标准不确定度(K=2)为0.013。

全球转基因油菜专利信息分析与技术展望

为了推动生物育种技术在农业领域的应用,了解全球转基因油菜作物的发展现状及种植、进出口、产业化情况,通过智慧芽数据库(PatSnap)对全球转基因油菜专利信息进行检索分析,展示了全球转基因油菜的发展趋势、聚焦重点技术领域、重点受理国家及各国研发能力、研发机构技术聚焦、应用布局、主要申请机构竞争力、专利法律状态等10余项数据指标,并对转基因油菜的研发、农业领域布局、全球化竞争及推进油菜产业化等方面提出了展望与建议。

非转基因抗ALS酶抑制剂大豆、油菜和玉米对除草剂的抗性研究

随着农业现代化和农村城镇化,除草剂的大面积使用将是趋势,具有除草剂抗性的作物,在种植过程中可以直接通过施用除草剂,杀灭田间杂草,而不伤害作物,从而提高生产效率和作物产量.在培养皿培养条件下,采用室内生物测定方法,测定了非转基因抗除草剂的大豆、油菜和玉米种子在多种除草剂(烟嘧磺隆,甲咪唑烟酸,啶磺草胺,氯吡嘧磺隆,砜嘧磺隆,双草醚和氟唑磺隆)的不同浓度下的发芽情况.结果显示,抗除草剂油菜种子相对感除草剂油菜种子并没有显示出明显的除草剂抗性,而非转基因抗除草剂大豆和玉米相对敏感型玉米显示出明显的除草剂抗性.结果表明,在实验中所用的抗除草剂油菜品种推广过程中,不能使用啶磺草胺、氯吡嘧磺隆和砜嘧磺隆这3种除草剂,以免抑制种子生长;是否能够使用烟嘧磺隆和甲咪唑烟酸这两种除草剂,需要进一步精确的实验论证;在本实验中所用的抗除草剂大豆品种推广过程中,可以使用啶磺草胺、甲咪唑烟酸、双草醚、氟唑磺隆和烟嘧磺隆这5种除草剂,浓度在4X以内时,不会对大豆芽生长产生抑制作用;在实验中所用的抗除草剂玉米品种推广过程中,不能使用甲咪唑烟酸和双草醚,可以使用烟嘧磺隆,能否使用啶磺草胺、氟唑磺隆这两种除草剂,需要进一步精确的实验论证.研究结果为非转基因型抗除草剂油菜、大豆和玉米种子的推广奠定了基础.

油菜的遗传转化及抗溴苯腈转基因油菜的获得

以油菜(Brassica napus L.)的下胚轴和子叶为转化受体,建立了油菜的高效转化系统。在此基础上,将抗除草剂溴苯腈基因(bxn基因)导入油菜,获得了抗溴苯腈转基因油菜。分子检测实验证明,转基因油菜中含有bxn基因。转基因油菜可抗高达10^(-3)mol/L的溴苯腈。

抗芜菁花叶病毒转基因甘蓝型油菜的研究

以子叶柄为材料，建立了甘蓝型油菜（ＢｒａｓｓｉｃａｎａｐｕｓＬ．）双低品种的再生体系。通过子叶柄与农杆菌（ＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓＬＢＡ４４０４）共培养，将表达载体ｐＢＴｕ中芜菁花叶病毒外壳蛋白（ＴｕＭＶ－ＣＰ）基因以整合方式导入甘蓝型油菜，然后用卡那霉素进行筛选，获得了油菜再生植株。经ＰＣＲ特异性扩增、点杂交和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹分析，证明再生植株基因组ＤＮＡ中整合了ＴｕＭＶ－ＣＰ基因。攻毒实验表明，有ＴｕＭＶ－ＣＰ基因插入的工程油菜对ＴｕＭＶ均有不同程度的抗性。

表达barstar基因及bar基因的转基因油菜的研究

从细菌Ｂａｃｉｌｕｓａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ染色体ＤＮＡ中克隆了ｂａｒｎａｓｅ抑制剂ｂａｒｓｔａｒ的基因，构建了带有ＴＡ－２９基因５′调控区（－１３００－＋３）与ｂａｒｓｔａｒ基因编码区、ＣａＭＶ３５Ｓ启动子与除草剂抗性基因ｂａｒ两个表达框架的植物表达质粒ｐＢＢＳ。以“双低”油菜“５－４”的子叶柄为受体，通过农杆菌介导的遗传转化，获得了在含有１０ｍｇ／Ｌ卡那霉素和２０ｍｇ／ＬＰＰＴ的筛选培养基上再生的转基因植株。ＰＣＲ分析结果表明，ｂａｒｓｔａｒ基因已整合到油菜染色体上；Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ检测表明，ｂａｒｓｔａｒ基因及ｂａｒ基因在转基因植物中得到了正确的调控与表达。以转基因油菜“５－４”为父本授粉给表达ｂａｒｎａｓｅ基因的雄性不育植株，不育株能正常结实。

导入β-1,3-葡聚糖酶及几丁质酶基因的转基因可育油菜及其抗菌核病的研究

利用农杆菌转化法,将组成型表达β1,3葡聚糖酶及几丁质酶基因的双价植物表达载体pBLGC转化优质甘蓝型油菜品种H165,并得到了抗卡那霉素(Kanamycin,Kan)的再生植株。我们对所得到的抗Kan的再生苗进行了初步分子生物学检测,结果表明,在K15(Kan15mg/L)培养基上的绿苗中有30%为PCR阳性植株,而在K25(Kan10mg/L)培养基上的绿苗有53%的阳性率。对部分PCR阳性的转基因植株进行了点杂交分析,结果均表现出较强的杂交信号,这初步说明外源基因已整合到油菜基因组中。转基因植株的活体接种油菜菌核病菌(Sclerotiniasclerotiorium)试验表明,部分转基因植株比对照显示较强抗病性。

转基因雄性不育油菜选育的简介

转基因雄性不育油菜选育的简介彭仁旺，周雪荣，方荣祥，陈正华，莽克强（中国科学院微生物研究所，北京１０００８０；中国科学院遗传研究所，北京１００１０１）杂种优势的利用是作物生产中用以提高产量、改进品质的重要措施之一，通过雄性不育系培植杂种是杂种优势利用...

能以植酸磷为唯一磷源生长的转基因甘蓝型油菜

由于难溶性矿物磷酸盐和有机磷的大量存在，土壤总磷虽高，但多数土壤缺乏有效磷，这是世界范围内农业生产的主要限制因素之一。土壤中有机磷的存在形式主要是植酸，为了提高土壤有效磷供给，利用根癌农杆菌菌株LBA4404，通过两步再生方法将植物表达载体pBINPR-phyI中含有的带胞外分泌信号肽序列的植酸酶基因转入油菜品种中双6号中，并获得转基因油菜56株，转化效率0．16％～9．20％。分子检测和酶活性检验表明，植酸酶基因已导人中双6号，转基因植株能有效表达植酸酶基因并向根外分泌植酸酶，转基因植株能以植酸为唯一磷源正常生长，非转基因植株则不能。结果表明，转基因植株根系分泌大量高活性植酸酶有助于土壤中有机磷释放出有效磷供植物利用；利用基因工程技术提高植物对土壤闭蓄态有机磷利用效率的前景是可期待的。

甘蓝型油菜抗虫转基因植株及其抗性分析

通过油菜子叶外植体-农杆菌共培养法将苏云金杆菌杀虫蛋白基因导入甘蓝型油菜，获得抗虫的转基因植株。带有1～2mm子叶柄的油菜子叶经农杆菌感染后，共培养2～3天，然后转移到附加15mg／L卡那霉素的MS选择培养基上筛选转化愈伤组织及不定芽。卡那霉素抗性苗相继在含20～50mg／L卡那霉素的选择培养基上继代培养，再转移到合25mg／L卡那霉素的生根培养基上诱导生根。以苏云金杆菌杀虫蛋白基因为探针，进行Southernblot分析，证明外源基因已整合到油菜基因组中。部分转基因植株具有明显的杀虫活力，用转基因植株叶片饲喂甜菜夜蛾等幼虫后，幼虫出现中毒症状，导致幼虫发育受阻和死亡。转基因植株的抗虫性和卡那霉素抗性在自交后代中得到保持，外源基因星核基因单一位点显性遗传。

转基因油菜筛查检测策略研究

根据收集到的国内外已商业化转基因油菜品种的基因元件信息,构建了油菜转基因检测分子特征矩阵,在分析基因元件使用频率的基础上,建立了转基因油菜的筛查检测策略。研究发现,利用P-CaMV35S、P-FMV35S和bar这三个元件组合,对现有转基因油菜品种的筛查检出率可达100%。将P-CaMV35S、P-FMV35S、bar、CP4-EPSPS、PAT和T-NOS组合,每个转化事件可检出至少两次,增加了检测的可靠性。同时,分析了不同转化事件中同名基因元件的序列差异,进一步验证了分子特征矩阵筛查方法的可行性。

甘蓝型油菜Fad2基因的RNA干扰及无筛选标记高油酸含量转基因油菜新种质的获得

利用已获得的油菜种子贮存蛋白——十字花科蛋白(cruciferin)基因的启动子和终止子,构建了无选择标记基因且同时具有正义及反义结构的油酰去饱和酶基因(Fad2)种子特异表达RNAi载体,并通过农杆菌介导的转化,获得了只含有油菜原有基因且Fad2基因表达受抑制的转基因植株。RT-PCR分析结果表明,在油酸含量达到83.9%的转基因植株中未检测到在非转基因植株中普遍存在的Fad2基因转录mRNA——一种典型的RNA干扰现象。通过对植株生长发育状态的观察比较,该高油酸含量转基因株系并未表现出双突变体中由于Fad2基因的失活所引起的植株抗寒能力差、发育迟缓、花蕾死亡、结实率低等不利农艺学性状。

油菜农杆菌转基因体系的建立及转PEP反义基因油菜的获得

本研究建立了油菜农杆菌转基因技术体系，用根癌农杆菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）共培养法将ＰＥＰ反义基因导入甘蓝型油菜（ＢｒａｓｉｃａｎａｐｕｓＬ．）主栽品种浙油７５８和浙优油１号，获得高含油量的油菜植株。实验所用外植体为培养８～１０ｄ的无菌苗下胚轴；农杆菌为ＥＨＡ１０１（含ＡｎｔｉＰＥＰ／ＰＩＧ１２１），外植体经农杆菌感染后共培养２ｄ，转入含５００ｍｇ／Ｌ羧青霉素的ＭＳ培养基上，１周后转入含羧青霉素及潮霉素的培养基上，以后每２周继代一次至出现抗性芽，转化频率为２７５％（浙优油１号）；分化的茎芽在含相同抗生素的生根培养基中生根并长成完整小植株，转入土壤成为正常植株。经ＧＵＳ组织化学染色及ＰＣＲ扩增检测，证明外源基因已插入油菜基因组并得到表达。

抗草丁膦和抗草甘膦转基因油菜的抗性基因向野芥菜的流动

通过人工去雄授粉和田间隔行种植试验,研究了抗草丁膦和抗草甘膦转基因油菜(Brassica napus)中的bar基因和EPSPS基因向野芥菜(B.juncea var.gracilis)流动的可能性。结果表明在人工授粉的情况下,以野芥菜为母本,分别以两种转基因油菜为父本,亲和性指数都很高,达13以上,与野芥菜自交或开放授粉条件下的亲和性指数没有明显差异,说明两种转基因油菜和野芥菜的亲和性较好。经两次除草剂筛选,人工杂交获得的所有F1对相应的除草剂都表现出了明显的抗性,且经PCR检测扩增出了各自的特异性条带,说明人工杂交获得的所有F1都携带了相应的抗性基因。F1的适合度研究表明,两种F1种子萌发率和母本都没有明显差异,营养生长明显好于母本。但花粉活力和结实率明显下降,携带抗草丁膦基因F1的花粉活力和每角果粒数分别是32.4%和0.59粒,携带抗草甘膦基因F1的花粉活力和每角果粒数分别是35.1%和0.58粒。经两次除草剂筛选和PCR检测,表明野芥菜和抗草丁膦油菜或与抗草甘膦油菜田间隔行种植分别能产生0.02%和0.014%的携带抗性基因的F1杂种。以上结果表明抗除草剂转基因油菜的抗性基因具有向野芥菜流动的可能性,且bar和EPSPS基因向野芥菜流动的可能性类似,但对其可能引起的环境后果需要做进一步地深入研究。

转基因抗虫油菜中Bt杀虫蛋白基因稳定遗传和高效表达及抗虫性研究

通过对转 Bt杀虫蛋白基因油菜植株的后代进行卡那霉素抗性分析和 PCR技术检测 ,结果表明 :Bt杀虫蛋白基因是以单拷贝、杂合地整合到转基因植株 (T0 1、T0 2、T0 3、T0 5、T0 6、T0 7、T0 8)的基因组中 ,并稳定地遗传。EL ISA检测表明 :在第 3～第 9叶期 Bt杀虫蛋白基因在转基因油菜植株中高效地表达 ,Bt杀虫蛋白的表达量为 170～ 2 6 0 ng/ 2 5mg鲜叶 ,占植物可溶性蛋白的 0 .0 6 7%～ 0 .10 5 % ,其抗虫效果高达 72 .0 %～ 94 .4 %。但从第 11叶期后 Bt杀虫蛋白表达量显著地降低 ,只有 7～ 5 0 ng/ 2 5 mg鲜叶 ,占植物可溶性蛋白的 0 .0 0 3%～ 0 .0 2 %。

转基因抗除草剂油菜对十字花科杂草的基因漂移

以转基因抗除草剂油菜Q3为花粉供体材料,油菜远缘杂草为花粉受体材料,在自然传粉和人工辅助授粉条件下研究甘蓝型油菜与十字花科杂草间的基因漂移频率。结果表明,以转基因油菜为父本,十字花科杂草荠菜、碎米荠、播娘蒿、诸葛菜、风花菜、遏蓝菜和菜为母本,杂交高度不亲和,基因漂移率为0 % ,无生态风险,但对野芥菜的基因漂移率高达0 .885 %。野芥菜是我国大部分地区的常见杂草,种类繁多,分布范围广,大面积种植转基因抗除草剂油菜对野生芥菜的基因污染应引起高度重视。

转基因抗虫油菜品系选育和性状研究

为选育优质抗虫油菜新品系 ,在 Bt毒蛋白基因成功地转化到甘蓝型双低油菜品种湘油 13号后 ,对其植株性状、农艺性状和品质性状进行筛选 ,获得稳定的转 Bt基因油菜品系 .该品系除前期叶片稍大、叶色稍淡、苗期抗虫性较强外 ,其他性状与湘油

不同TAIL-PCR通用引物在转基因大豆、水稻、油菜侧翼序列分离中的应用评价

为研究不同转基因作物T-DNA插入位点侧翼序列分离中所用的通用简并引物对TAIL-PCR的影响,本研究使用5个通用简并引物分别对8个转基因大豆、30个转基因水稻和2个转基因油菜株系进行了TAIL-PCR分析,结果表明,5个简并引物在TAIL-PCR中的扩增效果存在显著差异,同一简并引物在不同转基因物种的扩增效果显著不同。AD1引物在转基因水稻和转基因油菜中扩增效果较好,AD2引物在转基因水稻、油菜和转基因大豆中扩增效果均较好,AD3引物在转基因水稻中扩增出1个株系,在转基因油菜中扩增出1个株系,但AD3引物与pFGC5941 T-DNA RB上游有匹配,不适用于以pFGC5941为载体的转基因材料分析。AD4和AD5 2个引物在3个转基因物种的扩增均较差。对AD1和AD2两个引物的TAIL-PCR扩增产物进行测序,结果表明,扩增产物均对应转基因材料的侧翼序列。研究表明,不同通用引物在不同转基因事件中侧翼序列的分离效果差异较大,通用引物AD1和AD2TAIL-PCR成功率最高。不同通用引物的应用效果不仅与不同物种有关,也与外源基因的插入位点有关,而且还与载体序列匹配程度相关。为提高TAIL-PCR中T-DNA插入位点侧翼序列分离成功率,建议同时采用多个通用引物平行扩增。

转基因抗草甘膦油菜的实用PCR检测方法

利用定性PCR技术 ,建立了检测孟山都公司培育的转基因抗草甘膦油菜中的epsps、gox和fmv35s的方法 ,同时设立了阳性内对照napin。该方法的检测灵敏度为 0 .0 5 %。利用复合PCR可以在一个PCR反应中同时检测出epsps、gox、fmv35s和napin基因。这种方法可以有效地用于转基因抗草甘膦油菜中的外源基因的检测。

转基因高油酸油菜T-DNA插入拷贝数及整合位点分析

为获得转基因高油酸油菜T-DNA插入拷贝数及整合位点相关信息,本研究应用地高辛标记的NPTII基因片段为探针,与经BamHI酶切的转基因甘蓝型油菜高油酸株系W-4的T2代单株的基因组DNA进行Southern杂交。结果显示:W-4的T2代单株的基因组含有一个T-DNA拷贝。用3到4个根据载体pCNFIRnos序列设计的嵌套特异性引物分别与简并引物组合进行TAIL-PCR反应,扩增得到转基因油菜T-DNA插入位点的左、右边界旁侧序列。经分析右边界旁侧序列长度为470bp,其中180bp为载体序列,290bp为W-4的基因组序列;左边界旁侧序列长度为641bp,其中365bp为W-4的基因组序列,276bp为载体序列。序列比对结果发现该转基因事件中,T-DNA左边界序列完全整合到油菜基因组中,仅有1个碱基由G转换成了A。而右边界则缺失了包括RBborder在内的62个碱基。结果表明:转基因高油酸油菜T-DNA的整合是一次无其他额外载体序列的整合。blast分析获得的与左右边界相连的油菜基因组序列,未检索到与之高度同源的序列,推测T-DNA插入位点可能位于油菜基因组非编码区。综上所述,本研究分析了转基因油菜W-4基因中T-DNA拷贝数、整合特点和旁侧序列,研究结果为转基因油菜的生物安全性评价以及转基因高油酸油菜的检测提供重要的基础信息。