自切割核酶介导的转基因淋巴细胞有效抑制猴免疫缺陷病毒的感染和致病

目的 获得抗猕猴免疫缺陷病毒 (SIV)转基因的淋巴细胞。方法 将锤头型核酶切割的一段靶序列连接在核酶下游构成自切割核酶 ,人工合成的自切割核酶基因扩增并克隆在pBluescriptSK的XhoI SalI位点 ,通过连续 4次克隆获得 10拷贝核酶基因的载体。转染前测定自切割核酶的体外活性并将之转移至哺乳动物表达载体上 ,脂质体法转染含核酶基因的表达载体 ,转染细胞在含 40 0mg/LG418的培养介质中筛选。转基因细胞对猴免疫缺陷病毒的抗性通过免疫荧光测定来估测。结果 37℃孵育 15min后 85 %的十体核酶自切割成单体核酶。在初始 2 5min的反式切割反应中尽管10体核酶摩尔数不足单体核酶十分之一 ,但十体核酶平均超过单体核酶 13 31%的切割产物。Northern点杂交证明单体核酶基因和十体核酶基因已经转入细胞并在细胞中获得表达。SIV攻毒试验表明 ,SIV接种 6d后转染单体核酶基因的细胞生长正常 ,不出现融合细胞 ,绝大多数转染十体基因的细胞生长良好 ,只发现极少数的融合细胞 ;转染单体核酶基因细胞的SIV抗原阳性细胞抑制率达到10 0 % ,转染十体核酶基因细胞的SIV抗原阳性细胞抑制率为 91 2 % ,转空表达载体细胞为 48%。结论 转自切割核酶基因的细胞对SIV的感染和致病均表现较强的抗性 ,但单体核酶比

Ly49A 基因转染的淋巴细胞对H—2^d小鼠正常和肿瘤细胞杀伤活性的实验研究

目的 观察Ly49A基因转染的C5 7BL/ 6小鼠的淋巴细胞对BALB/c小鼠正常成纤维细胞和 4T1乳腺癌细胞杀伤能力的变化与差异。方法 构建逆转录病毒表达载体pLXSN Ly49A ,经由PA317包装细胞包装后转染C5 7BL/ 6小鼠淋巴细胞。流式细胞仪检测Ly49A受体在转染后淋巴细胞上的表达率。MTT法检测转染后淋巴细胞对BALB/c小鼠正常成纤维细胞和 4T1乳腺癌细胞的杀伤活性 ,以空载体转染和未转染的淋巴细胞作对照。结果 Ly49A基因转染的C5 7BL/ 6小鼠的淋巴细胞 2 4h后Ly49A受体表达率为 (4 6 .6 7± 0 .35 ) % ,空载体转染组为 (18.73± 0 .85 ) % ,未转染对照组为 (19.6 0± 0 .2 7) % ,其对BALB/c小鼠正常成纤维细胞的杀伤活性明显降低 (抑制率 2 2 %～ 2 5 % ) ,对 4T1乳腺癌细胞的杀伤活性无明显改变 (P >0 .0 5 )。结论 转染Ly49A的C5 7BL/ 6小鼠淋巴细胞对BALB/c小鼠正常细胞的杀伤作用明显降低 ,但仍保留了对肿瘤细胞的杀伤活性 。