利用体细胞核移植技术制作人胰岛素原转基因牛(英文)

通过体细胞核移植技术制作了人胰岛素原转基因牛。在CMV启动子指导下以内部核糖体进入位点序列(IRES)连接的新霉素抗性基因和绿色荧光蛋白基因组成了双重标记基因的筛选系统,用于转基因细胞的富集以及细胞和植入前胚胎的筛选。转基因通过电穿孔的方法(900V/cm,5ms)转入体外培养的牛胎儿成纤维细胞,基因转染细胞在添加G418 (800μg/mL)的培养基中培养10天以富集转基因细胞。选择表达绿色荧光蛋白的转基因细胞作为核供体进行体细胞核移植,重构胚经体外培养至囊胚阶段,选择表达绿色荧光蛋白的囊胚进行胚胎移植。为比较基因转染以及供体细胞所处周期对转基因细胞核移植胚胎发育的影响,用作核移植供体的转基因细胞或非转基因细胞先饥饿培养2—4天(0.5 %FBS) ,然后恢复培养(10%FBS) 10 h使细胞同步化于G1期,以正常培养的细胞作为对照进行核移植。结果表明,转基因细胞作为核供体得到的核移植胚胎的体外囊胚发育率低于以非转基因细胞为核供体的对照组(23.2% VS 35.2 %,P<0.05) ;转基因细胞周期同步化处理与否对其克隆胚囊胚发育率无显著影响(23.2% VS 18.9 %,P>0.05)。胚胎移植后2个月直肠检查发现7头受体牛(每头移植2—4枚胚胎)中有一头妊娠,并最终发育足月产下一头小牛。聚合酶链反应(PCR)检测和DNA测序分析表明其为转人胰岛素原基因的转基因克隆牛。

转基因牛多重PCR检测方法的建立

为建立一种快速检测转基因牛的多重PCR方法,针对牛线粒体16 S rRNA基因(BOS mtD-NA16 S rRNA,BOS)、转基因动物常用标记基因新霉素磷酸转移酶基因(NPTⅡ)、人乳铁蛋白编码基因(humanlactoferrin gene,hLF)、人-α-乳清蛋白编码基因(humanα-lactalbumin gene,hα-LALBA)和人溶菌酶编码基因(humanlysozyme gene,hLYZ)设计了5对特异性引物,通过对扩增条件的优化,建立转基因牛的多重PCR检测方法。利用人乳铁蛋白转基因牛、人溶菌酶转基因牛、人α-乳清蛋白转基因牛样品和其他转基因动物样品进行了敏感性和特异性试验。结果表明方法具有较好的特异性和敏感性,与转人防御素3基因奶牛样品和转omega-3基因猪样品等均无交叉反应,最低检出限达1 ng,该方法既可筛查转基因牛样品,又可进一步确认转基因牛外源基因,适合转基因牛的快速检测。

动物转基因技术在转基因牛中的研究进展

本研究综述了目前应用于转基因牛中原核显微注射法、体细胞克隆法、病毒载体法等传统动物转基因技术以及具有应用前景的ZFN技术、TALEN技术和iPS技术等。概述了20年来国内外转基因牛重要的研究进展,并就目前转基因牛在乳腺生物反应器、抗病育种、品种改良主要3个方面的应用进行了介绍。在此基础上,就目前转基因牛育种中存在的问题及今后发展趋势进行了讨论,以促进转基因牛技术的发展。

fat-1转基因牛血浆差异蛋白的研究

以fat-1转基因牛血浆蛋白为材料,利用2D-双向电泳、生物信息学及血脂生化检测技术对fat-1基因调控牛脂类代谢的潜在机制进行了研究。结果表明,8个相关差异蛋白(AHSG、KNG1、Serpin A3-1、ENSBTAG00000021729、Serpin A3-5、FAM208A、CTAGE5、LOC511240)被鉴定;经生物信息学预测,发现有63个蛋白与这8个差异蛋白存在互作关系,而且发现差异蛋白和互作蛋白富集了11个与脂类代谢密切相关的生物学通路,其中互作蛋白APOA1在11个通路中富集的频率最高;经血浆APOA1检测发现,转基因牛显著高于野生型牛;相关性分析发现APOA1与低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)高度负相关(r=-0.90),与高密度脂蛋白胆固醇/总胆固醇(HDL-C/TC)的比值存在显著正相关(r=0.69)。综合结果显示了fat-1基因可能通过介导APOA1的表达调控转基因牛的脂类代谢。

转基因牛与非转基因牛性控精液分离及配种效果初探

本研究对转基因牛以及非转基因牛精液经流式细胞仪分离冷冻后精子活力、分离准确率进行了比较,同时对分离的性控冷冻精液进行了人工输精,对受体牛的情期受胎率进行了统计分析。结果表明,转基因牛与非转基因牛精液在冷冻解冻后活力以及分离准确率方面差异不显著(P>0.05);转基因牛与非转基因牛的性控冷冻精液的情期受胎率分别为57.4%、59.3%,二者之间差异不显著(P>0.05)。

Fat1转基因牛奶对小鼠健康和生殖能力的影响

目的通过饲喂试验,分析fat1转基因牛奶对小鼠行为、健康和生殖能力等的影响。方法取4周龄的B6D2F1/Vr小鼠36只,随机分成6组,每组6只,雌雄各半。分别在饲料中添加fat1转基因牛奶、克隆牛奶和普通牛奶,对上述3组鼠进行饲喂。定期对饲喂小鼠进行称质量,并统计摄食量;在饲喂14周后,每组小鼠均1∶1合笼;生育3次后,记录各组产仔量。同时,对每组小鼠进行血常规和血清生化指标分析。在整个试验期间,定期观察3组小鼠行为,并测量体质量。最后,处死小鼠,分别取各个器官进行称质量。结果与饲喂普通牛奶组相比,饲喂转基因牛奶组和克隆牛奶组的小鼠在体质量、行为、繁殖能力和大部分重要的血液生理生化指标、组织器官的质量等方面均没有显著差异。结论 fat1转基因牛奶对小鼠的健康和生殖能力没有明显不利的影响,表明fat1转基因牛奶对于动物的饮食是安全的。

阿根廷利用转基因牛提取人体胰岛素

据阿根廷《民族报》报道，阿根廷科学家己成功繁育出能够生产人体胰岛素的转基因牛。据负责此项实验的阿根廷BioSidus公司介绍，今年3月该公司在位于布宜诺斯艾利斯省北部的奶牛场成功繁殖了4头转基因牛犊。

四十头转基因牛即将降生

美国 Granada Genetics 公司(得克萨斯州柯勒吉斯特欣)宣布,它所培养的40头转基因牛将于1989年2月出生。如生产顺利,它们将是第一批基因重组牛。利用基因重组改良家畜,是生物技术今后的重大课题。在美国,已有几个生物技术企业正进行这方面的工作。但是,对于实验成本较高的牛,现在几乎都只停留在进行利用小鼠的模型实验。

转基因牛杂交成功

美国GenPhrm International公司宣布首次转基因牛杂交成功,94年1月初诞生8头犊牛。估计其余的牛要到94年8月诞生。 该公司91年8月在荷兰开发转基因牛“Herman"(用微穿孔技术在牛受精卵中导入人乳铁蛋白基因)获得成功。但是,因为“Herman”是雄性。所以,必须通过人工受精杂交“Herman”的精液。

与牛共舞——培养转基因牛的故事

培育转基因牛比培育转基因羊更加重要,原因是:一、喜欢喝牛奶的人远远超过喜欢喝羊奶的人。二、这点很重要——一头母牛比一头母羊能产更多的奶。一头母牛一年的产奶量可高达一万公斤。比一头普通的母羊高出二十倍。 培养转基因动物的基本原理和目的是:把含有关键人类基因的DNA注入哺乳动物胚胎,使产奶家畜分泌的乳汁中含有具备治病效果的蛋白质。

美日科学家培育出免患“疯牛病”的转基因牛

美国和日本的研究人员近日宣布,他们培育出一种不产生朊蛋白的牛胚胎。由于这种蛋白质的变异会导致"疯牛病",所以,研究者认为这些胚胎发育成的牛很可能会免患"疯牛病"。无论是健康牛,还是患有"疯牛病"的牛体内均产生朊蛋白。而病牛体内的朊蛋白发生了变异,并在牛脑部迅速扩散,造成协调性差、行为异常等问题,最终会导致病牛死亡。据《自然》杂志网站6月3日报道。

访转基因牛“滔滔”之“父”

今年1月,上海医学遗传研究所开展的转基因牛的研究成果,被评为中国1999年十大基础研究成果,并名列榜首。转基因牛“滔滔”(携带人白蛋白基因)和它的培育者——曾溢滔、黄淑帧夫妇,引起传媒和广大读者的浓厚兴趣。为此,《转基因动物与生物制药》一书的编辑方鸿辉专门就该课题对中国工程院院士曾溢滔进行了访谈。

新疆转基因牛研究取得可喜进展

新疆畜牧科学院与中国农业大学合作进行了“精子载体转基因牛乳腺表达人胰岛素原”的研究。把转基因动物作为“生物反应器”生产对人类及动物有重要价值的各种产品是当前动物生物技术领域的热点研究课题。1995年,新疆畜牧兽医生物技术实验室(农业部级重点开发实验室)郭志勤研究员等用精子作为外源DNA载体转移人类胰岛素原基因,采用人工授精技术对400头母牛进行授精。

动物转基因技术在转基因牛中的研究进展及其应用

动物转基因技术已应用于生命科学的各个领域,特别是在研究基因功能、转基因动物培育、生物制药、提高畜禽的生产性能和防治疾病等方面得到了广泛应用。文章就动物转基因技术在转基因牛中的研究进展,以及在牛的基因功能研究、生物制药、防治疾病和改良品种等领域的应用和前景进行了综述,以期推进动物转基因技术在牛生产中的进一步发展。

转基因克隆牛外源基因整合位点的研究

整合位点的侧翼序列是外源基因表型研究和功能探讨的前提条件,对目的基因的正常转录和表达有着重要影响。本试验利用热不对称交措式PCR(Thermal Asymmetric Interlaced PCR,TAIL-PCR)的方法克隆了目的基因。结果表明:外源基因整合到牛的12号染色体基因组克隆(NW_003104315.1)中。分析了整合位点的纯合性发现转基因牛为整合位点杂合子。TAIL-PCR法能够有效、快速的鉴定外源基因在基因组中的整合位置,具有良好的应用前景。

实时荧光定量PCR法检测转基因牛拷贝数

为了检测bfat-1转基因牛的外源基因拷贝数,试验采用绝对定量PCR法鉴定外源基因的拷贝数。结果表明:绝对定量PCR可以准确、有效地检测转基因牛外源基因的拷贝数,标准曲线为lnN=-3.16Ct+40.76(R2=0.994 2),2头转基因牛的外源基因拷贝数分别为4.62±1.03,5.46±1.26。

首批转基因克隆牛成功繁育后代

日前,2012年出生的首批含有脂肪性脂肪连接蛋白基因的体细胞转基因克隆牛"妞妞"成功繁育后代,第二代"转基因小牛"出生后各项体征正常,身体健康。这意味着我国应用体细胞克隆技术培育自主品牌的肉牛新品种迈出了关键一步,国人有望早日吃上国产"雪花牛肉"。国家转基因重大专项课题"优质高效转基因肉牛新品种培育"负责人,北京农学院教授倪和民说。