实时荧光定量PCR检测转基因玉米MON863结构特异基因的测量不确定度

[目的]对实时荧光定量PCR检测转基因玉米MON863结构特异基因的测量不确定度进行评定。[方法]使用转基因玉米MON863结构特异实时定量PCR方法测定含量为1%的转基因玉米MON863样品(CRM)中结构特异片段的含量,并从扩增反应、数据处理以及微量移液器等不确定度来源,评定测量的不确定度。[结果]研究得到uA=1.7×10-2,uB=9.0×10-4,uC=1.7×10-2,U95=0.036,测量结果为1.08%±0.036。[结论]转基因玉米MON863结构特异实时定量PCR方法检测结果的主要不确定度来自检验过程中的随机效应。

转基因玉米MON87427梯度含量基体标准物质的研制

【目的】转基因检测标准物质是转基因生物安全监管、标识制度实施的物质基础,是实验室内检测数据溯源、实验室间检测数据可比的保证。中国于2017年批准进口转基因玉米MON87427用作加工原料,其安全监管和检测急需研制有证标准物质。【方法】以开发商提供的转基因玉米MON87427杂合种子和非转基因受体种子为原材料,对转基因玉米MON87427和其受体种子分别清洗、干燥、冷冻研磨、粒径及含水量检测,按质量分数(以干基计)称量配制得到质量分数分别为60.0、99.5和1000.0 mg·g^(-1)的转基因玉米MON87427基体标准物质MON87427a、MON87427b和MON87427c。运用实时荧光定量PCR进行粉末的均匀性初检,初检合格后分装。用MON87427/zSSIIb二重微滴数字PCR(ddPCR)方法进行标准物质均匀性、稳定性评估和8家实验室联合定值。根据《标准物质定值的通用原则及统计学原理》(JJF 1343)进行标准物质均匀性评估、稳定性评估、联合定值数据的处理及不确定度评定。【结果】本批标准物质有MON87427a、MON87427b、MON87427c 3个浓度,粒径小于200μm的粉末大于80%,含水量低于5%。用棕色玻璃瓶分装,不低于1.0 g/瓶,充氮后轧盖,3个浓度的标准物质各分装400瓶。3种标准物质均匀性检验的F值均小于临界值F0.05(14,30)(2.04),在瓶内和瓶间具有良好的均匀性,使用时,最小取样量为100 mg。标准物质在25℃、37℃和60℃条件下可稳定储存14 d,表明在常温下运输14 d标准物质特性量值不发生趋势性变化;在4℃和-20℃条件下长期稳定性达到12个月;开盖取样5次,标准物质特性量值未发生显著偏离。8家实验室联合测定的标准物质拷贝数比值无异常值、呈正态分布、且等精度,标准物质MON87427a、MON87427b、MON87427c的标准值及扩展不确定度分别为(2.92±0.44)%、(4.89±0.57)%、(52.1±3.4)%。【结论】研制的转基因玉米MON87427梯度含量基体标准物质均匀性良好,可稳定运输和储存,满足转基因玉米MON87427定性、定量检测需求,为转基因玉米MON87427的安全监管、定量标识制度的实施提供了可靠的有证标准物质。

Taqman-MGB实时荧光PCR定量检测转基因玉米MON863

运用实时荧光聚合酶链式反应技术(polymerase chain reaction,PCR)对转基因玉米MON863进行品种特异性检测和定量分析。通过设计玉米内源基因和外源基因边界序列特异性引物和Taqman-MGB探针,验证了内源基因的物种特异性和外源基因边界序列的品种特异性。利用已知转基因百分含量的MON863玉米作为标准品,进行荧光定量反应,建立定量标准曲线,通过标准曲线对玉米样品MON863玉米成份进行含量分析。结果表明,该方法重复性好,检测特异性强,最低检测限浓度达到0.001 ng/μL,即14个拷贝。由于使用实时荧光PCR技术,检测周期短,操作简便,可广泛运用于转基因玉米MON863的进出口检测和转基因产品的含量分析。

实时荧光定量PCR检测转基因玉米MON863的测量不确定度分析

应用四川省农业科学院分析测试中心实验室建立的转基因玉米MON863品系特异实时定量PCR方法,测定含量为1%的转基因玉米MON863样品(CRM)中旁侧片段(品系特异片段)的含量,并从扩增反应、数据处理以及微量移液器等不确定度来源评定测量的不确定度。结果表明,uA=1.9×10-2,uB=9.3×10-4,uC=1.9×10-2,U95=0.04,测量结果为1.108%±0.04。MON863品系特异实时定量PCR方法检测结果的主要不确定度来自检验过程中的随机效应。

转基因耐除草剂玉米MON87419品系特异性定性PCR检测方法的建立

转基因耐除草剂玉米MON87419是由孟山都远东有限公司研发的玉米转化体,能够耐受麦草畏和草铵膦2种除草剂,已向我国申请进口用作加工原料的转基因生物安全证书。本文旨在建立转基因耐除草剂玉米MON87419转化体的特异性定性检测方法,以MON87419转化体特异性序列为靶标,设计一系列特异性引物,进行引物筛选、特异性测试、反应条件优化、灵敏度测试、检出限测试和再现性测试等试验。结果表明,本特异性检测方法的主要技术参数全部符合相关转基因分子检测标准的要求,特异性片段大小为216 bp,品系特异性高,灵敏度低至0.05%,检出限达到0.1%,具有良好的再现性和重复性。本方法的建立可为该转基因品系及其衍生产品的检测和安全监管提供有效技术支撑。

环状等温扩增技术快速检测转基因玉米MON863的研究

采用环状等温扩增技术(Loop-Mediated Isothermal Amplification,LAMP),针对转基因玉米品系MON863中玉米基因组与外源基因结合处设计4条特异性引物,建立MON863的快速检测技术体系,并对时间、温度等反应条件及体系灵敏度、特异性等进行探索。结果表明:该检测体系最适反应温度为63℃,反应时间60 min,灵敏度是常规定性PCR的10倍。该检测方法具有高度的特异性和稳定性,操作方便、简单、省时。

转基因抗虫耐除草剂玉米MON87411精准定量检测方法的建立

【目的】抗虫耐除草剂玉米MON87411是孟山都远东有限公司利用农杆菌介导方法研发的玉米转化体,已获得我国进口用作加工原料的农业转基因生物安全证书。为满足生物安全监管的要求,亟需建立该转化体的定量检测方法。【方法】根据抗虫耐除草剂玉米MON87411的两端旁侧序列信息设计引物和Taqman探针,进行引物筛选、特异性检测、PCR体系优化、标准曲线建立、正确度及精密度检测、检出限及定量限测试、微滴数字PCR方法验证等。【结果】该方法能特异、定量地检测出抗虫耐除草剂玉米MON87411转化体成分,检出限低至10拷贝,定量限为40拷贝。对测试样品定值准确,经微滴数字PCR方法验证结果一致。【结论】本方法为该新品种转基因玉米品系的精准定量提供了一种新的检测方法,为生物安全监管提供了有效的技术支撑。

环介导等温扩增法检测转基因玉米MON89034

根据MON89034外源插入片段与植物基因组序列设计特异性引物,筛选最佳引物并对反应体系和反应条件进行优化,最终建立转基因玉米MON89034转化体特异性LAMP检测方法。对该方法进行了特异性、灵敏度、稳定性和重复性测试。结果表明:该方法能够特异性检测出MON89034玉米;检测其灵敏度达到1 pg;以转基因玉米MON89034 DNA标准品质量分数为1.00%,0.10%,0.05%的样品为模板,其稳定性好、重复性高,假阴性率为0。本试验设计的LAMP方法适用于特异性检测转基因玉米MON89034。

LAMP实时浊度法快速检测转基因玉米MON810

LAMP实时浊度法是采用环介导等温扩增(Loop Mediated Isothermal Amplification,LAMP)技术通过实时浊度仪实时检测反应过程中所产生的白色沉淀,从而实现对扩增全过程的监控,弥补了显色法只能观看反应终点的缺陷,使引物筛选和反应体系的优化有数据可依。本研究以转基因玉米MON810为研究对象,针对外源基因苏云金芽孢杆菌杀虫毒蛋白CryIA(b)与内源基因边界序列设计6条特异性引物,通过实时浊度法在63℃的恒温条件下完成检测,对检测的灵敏度、特异性、稳定性进行了评价。建立了转基因玉米MON810的LAMP实时浊度检测方法,该方法最低检出限为0.5%,与LAMP显色法和实时荧光PCR法进行结果比对,符合率为100%,经评价具有特异性高、稳定性强、准确简便等优点,非常适合转基因玉米MON810的快速检测,有较好的应用价值。

实时荧光PCR定量检测加工产品中转基因玉米Mon810成分

采用实时荧光PCR技术,建立了定量(性)鉴定检测加工产品中转基因玉米Mon810成分的方法。实验设计的可以扩增玉米自身基因和外源基因边界序列的引物和探针具有品种和品系特异性,特异性地检测出食品、饲料等加工产品中转基因玉米Mon810成分。某些检测样品不仅检出转基因玉米Mon810成分,还同时检出其它转基因玉米品系或其它转基因品种。本研究实验建立的转基因玉米Mon810品系鉴定检测方法,即可以用于加工产品中转基因成分的定量检测(检测低限为0.1%),也可以用于定性检测,或作为常规PCR定性检测后的确证实验方法。

定性PCR方法检测转基因玉米MON810转化事件的研究

转基因玉米MON810(Yield Gard R)是孟山都公司通过DNA重组技术和微注射轰击研发的一种具有对欧洲玉米螟(ECB;Ostrinia nublialis)有特殊抗性的转基因玉米品系,目前在世界各地已经得到广泛种植,为加强对该品系玉米的安全管理,本研究旨在建立MON810品系玉米的转化事件特异性定性PCR检测方法。根据MON810的插入序列信息,在3′端的侧翼序列处设计定性PCR检测的引物,检测MON810在其他几种常见转基因作物混合样品的特异性。结果表明,该方法具有很好的特异性。同时检测该引物系统的扩增灵敏度,结果表明,检测引物的灵敏度可达0.1%。建立的MON810特异定性PCR检测方法经全国7家实验室的验证,进一步证实该方法能够特异地检测出样品中的MON810转化事件,检测方法的灵敏度可达0.1%,且检测结果具有良好的可重复性和可重现性。MON810转化事件定性PCR检测方法的建立可满足于抗虫转基因玉米MON810及其衍生品种生物安全管理的需要。

PCR对转基因玉米MON810的鉴定检测

本研究成功建立了商业化种植的转基因玉米MON810的筛选检测和品种鉴定的PCR方法。该方法根据玉米自身IVR基因作为内源特异参照基因扩增226bp片段,检查模板DNA提取的质量,避免了假阴性结果;同时扩增CaMV35S启动子基因195bp片段,可以对MON810转基因玉米进行筛选检测;此外,根据MON810品种设计的特异性鉴定检测引物,可扩增Maizegenome/CaMV35S基因170bp片段和HSP/CryIA(b)基因194bp片段,具有很强的品种特异性,达到了对MON810转基因玉米的品种鉴定目的。PCR反应循环参数是94℃2min;94℃40sec,55℃60sec,72℃60sec,35次循环;之后72℃延伸5min。

转基因玉米MON810基体标准物质Q—PCR量值协同实验研究

针对3种不同转基因含量水平的转基因玉米MON810基体标准物质，组织7家实验室对其量值采用实时荧光定量PCR（Q-PCR）方法进行了协同实验研究，并对Q-PCR得到的参考值进行了不确定度分析。经过加权平均，转基因玉米MONS10A、B、C3个水平的基体标准物质转基因含量的Q—PCR方法参考值分别为0．51％±0．10％、1．1％±0．2％、4．7％±0．7％（k=2）。

转基因玉米MON88017测量不确定度的评定

为了解"不确定度传播"(GUM)和"概率分布传播"(MCM)2种方法在转基因成分测量不确定度评定中的差异及验证GUM法评定转基因成分测量不确定度的适用性,首次采用MCM和GUM法同时评定试样中转基因玉米MON88017质量分数的测量不确定度.研究结果表明:MCM与GUM法计算得到的转基因玉米MON88017质量分数的概率密度分布都为正态分布;MCM计算获得的MON88017质量分数的标准不确定度(0.04%)小于GUM法获得的不确定度(0.1%),MCM获得的MON88017质量分数的95%包含区间的范围(1.43%~1.59%)小于GUM法计算得到的95%包含区间范围(1.34%~1.74%).因此,采用MCM评定MON88017质量分数不确定度的结果优于GUM法的相应评定结果.由于GUM法对MON88017质量分数不确定度评定结果的概率分布呈正态分布,因此GUM法适用于转基因生物及产品的测量不确定度评定.

实时荧光定量PCR检测转基因玉米MON88017

为完善中国转基因生物及产品定量分析标准化技术体系,保障中国生物安全和降低生态风险,本研究建立了转基因玉米MON88017及产品的实时荧光定量PCR分析方法,并用特异性、准确度、灵敏度以及测量不确定度等指标评价了该方法。结果显示该方法分析转基因玉米MON88017特异性很强;29次重复测量含量为1.50%的转基因玉米MON88017样品,平均测量值(1.541%)接近真实值(1.50%),相对偏差为2.70%,测量值的变异系数为0.110 4,回收率为100.00%,测量不确定度为0.096;在97.5%的置信水平下能检测到最低含量为5个拷贝的MON88017分子片段。因此,本研究建立的转基因玉米MON88017实时荧光定量PCR方法具有较高的特异性、准确度和灵敏度,能为中国转基因生物安全监管提供良好的技术支撑。

环介导等温扩增法检测转基因玉米MON88017品系

建立了转基因玉米MON88017品系环介导等温扩增法检测方法。针对MON88017玉米基因组与外源基因结合处序列,设计5条特异引物,并对反应条件、特异性、灵敏度、稳定性、结果判断方法等参数进行研究,同时与实时荧光PCR检测方法进行比较,最终进行了5家同类型实验室的协同验证。结果表明本研究所建立的MON88017环介导等温扩增检测方法具有良好的特异性,其最低检出限为0.5%,在特异性、灵敏度和检测范围等指标上均优于传统的PCR技术,并且不依赖昂贵的大型设备,可以实现现场快速检测,检测成本与检测所需时间远低于实时荧光PCR。该方法具有快速、简便的优点,能满足实际工作要求。

转基因玉米MON87427/zSSIIb二重微滴数字PCR方法建立及应用

实施转基因产品定量标识制度需要建立准确可靠的定量检测技术和方法。数字PCR(dPCR)不依赖标准物质,实现对DNA分子的绝对定量,已成功用于转基因含量检测和标准物质定值。为建立可靠的dPCR方法,获得准确测量结果,本研究以耐除草剂玉米MON87427为材料,探索建立二重微滴数字PCR(ddPCR)的策略。以构建的聚合MON87427转化体和5个玉米内标基因的重组质粒pUC57-M为质控样品,将5个不同的玉米内标基因分别与MON87427组合,通过优化退火温度,根据阳性微滴与阴性微滴分辨率、中等信号强度雨滴数量及测量值与理论值的一致性等,确定了二重ddPCR组合为MON87427/zSSIIb,最适退火温度为58.4℃。MON87427/zSSIIb二重ddPCR的动力学范围为10~60000拷贝。对盲样进行定量检测,二重ddPCR的定量结果与荧光定量PCR有良好的可比性,表明MON87427/zSSIIb二重ddPCR可取代qPCR方法进行转基因玉米MON87427的定量检测及标准物质定值。

转基因玉米MON87419实时荧光定量PCR检测方法的建立

转基因玉米MON87419是耐受麦草畏和草铵膦两种除草剂的玉米新品系。为了建立转基因玉米MON87419实时荧光定量检测方法,本研究根据转基因玉米MON87419的3′端旁侧序列信息设计引物和Taqman探针,经引物筛选、PCR体系优化、特异性检测、标准曲线建立、正确度及精密度检测和定量限测试等试验,表明该方法能特异、定量检测出转基因玉米MON87419转化体成分,可以对0.1%以上的MON87419转基因成分进行准确定量。本研究结果可为该转基因玉米品系的安全监管提供有效技术支撑。

多重DPO-PCR检测转基因玉米MON810和MIR604体系建立

针对转基因玉米MON810和MIR604品系插入位点序列,分别设计品系特异性DPO引物,建立转基因玉米MON810和MIR604品系检测的多重DPO-PCR方法。结果表明,设计的DPO引物特异性强,灵敏度达0.5 ng/μL,并且对退火温度不敏感。该检测方法特异性强、灵敏度高,适合于对转基因玉米MON810和MIR604品系进行快速检测。

转基因玉米质粒分子国家标准样品的构建

本文研制转基因玉米常见的4个品系:BT11、MON810、NK603和T25质粒分子国家标准样品。研究重点包括目标序列和内标准基因序列的选择和扩增、标准样品定值和分析等。均匀性和稳定性结果表明,所研制的转基因玉米4个品系标准样品均匀稳定。采用PicoGreen DNA分子荧光定量方法定值标准样品。多家单位合作定值,确定标准样品的标准值及其不确定度。所研制的转基因玉米质粒分子标准样品获得了国家标准样品证书,适用于转基因产品的定量和定性测定。