转基因禽类载体构建与导入方法研究现状

表达载体的构建与导入是转基因禽类研究的两大关键技术。以逆转录病毒为载体,在转基因家禽的血清和蛋清中,表达外源蛋白的含量已达到了5.6 mg/mL。以慢病毒为载体的基因转移技术,在家禽中实现了输卵管组织特异性表达(蛋清中含量为200μg/mL),而且克服了转基因在传代过程中表达的沉默现象。国外,种蛋赤道面开窗未注射组的孵化率达到了70.1%(为对照组的84.4%),而在国内,通过专利技术(2007100342530)实现了种蛋赤道面开窗,切块铰链式的开启与自动复原的开口与封口技术,开窗未注射组孵化率也达到了65%,制作效率达到了每人每小时30多个。本文综述了转基因禽类慢病毒表达载体及其导入家禽的研究现状,并结合作者的研究经验,探讨了存在的问题和今后的研究思路。

早期胚胎血管显微注射慢病毒载体制备转基因禽类的研究

根据禽类独特的生殖生理特点及特殊的胚胎发育模式,把原始生殖细胞法、显微注射法和慢病毒载体法3种转基因技术结合起来,以期探索出简便、高效的生产转基因禽类新方法。在鹌鹑胚胎发育至第13~15期,血液循环中的原始生殖细胞(Primordial germ cells,PGCs)数目达到最高值,血管显微注射携带增强型绿色荧光蛋白基因(Enhanced green fluorescent protein,eGFP)的人类免疫缺陷病毒I型(Human immunodeficiency virus-1,HIV-1)慢病毒载体,每枚胚胎注入1μL,滴度为1×109 TU·mL-1。80枚鹌鹑种蛋,孵化出雏48只,孵化率为60%;对新生鹌鹑解剖后,在荧光显微镜下检测,其喙部、羽毛、眼部、大脑、血管、心、肝、脾、肺、肾、腺胃、肠系膜、小肠、大肠、输卵管、肌肉及爪上检测到绿色荧光蛋白表达,特别是在性腺中观察到绿色荧光蛋白广泛性表达。G0代28只雄性鹌鹑中,成功采集到21只精液,其中5只个体精子基因组经聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)检测阳性,阳性率为23.8%(5/21);在5只阳性个体的G1代46只后代中,有6只经PCR及印迹杂交(Southern blot)检测均为阳性,阳性率为13.0%(6/46)。利用胚胎发育至第13~15期血管显微注射慢病毒载体能够有效感染此时期迁移的PGCs,获得性系嵌合体个体,最终成功获得转基因后代。该方法简便、高效的生产出转基因禽类,必将为禽类转基因研究提供一种新的思路和方法。

谱写转基因禽类的科研新篇章

转基因动物制药是当今国际生物高科技领域的热点．具有巨大的商业开发潜力。家禽具有个体小、繁殖率高、世代周期短、表达水平高、试验成本低和便于集约化饲养等优点，最适合转基因动物制药的研究和开发。然而，由于家禽特殊的生殖生理特点．采用显微注射法等传统方法制备家禽转基因时，成功率仅有5％-10％。

转基因禽蛋——新一代基因工程生物反应器

利用转基因禽蛋作为生物反应器生产重组蛋白可能是未来基因工程最佳的表达系统之一 ,具有重要的经济价值 ,已引起越来越多的公司和研究人员的重视。由于禽类转基因的困难 ,尽管多年来人们在这个领域作过不懈的努力 ,但至今在其商业化进程方面仍未见有重要的突破。对该领域的研究进展和动向作出简要的评述。

供体细胞在鸡-麻鸭嵌合体胚胎中的发育

用微注射法将鸡的PGCs注入到麻鸭的胚盘下腔中 ,用鸡W染色体DNA探针通过原位杂交对供体细胞在嵌合体胚胎中的发育作了研究。 5 4个胚胎各器官都有不同程度的嵌合 ,其中肝脏的嵌合率最高 ,性腺最低。胚盘细胞移植法可制备鸡 -麻鸭的体细胞和种系嵌合体。

供体PGCs在鸡-鸭嵌合体胚胎性腺外的发育

通过微注射法将鸡原始生殖细胞 (PGCs)注入到鸭的胚盘下腔中 ,用鸡 W染色体 DNA探针通过原位杂交的方法对供体 PGCs在嵌合体胚胎性腺外的发育作了研究。结果表明 ,所取的 4 8枚胚胎中 ,有 18.8%的脑内和 2 3.

胚盘下腔显微注射慢病毒载体制备转基因鹌鹑

利用显微注射法给每枚新鲜鹌鹑种蛋胚盘下腔注射滴度为1×109 TU/mL人类免疫缺陷病毒I型(human immunodeficiency virus-1,HIV-1)慢病毒载体1μL,直接封口后孵化出雏,应用倒置荧光显微镜及分子生物学方法检测。结果显示:在注射慢病毒后第4天,倒置荧光显微镜下观察到发育胚胎卵黄膜上绿色荧光蛋白较强表达;试验操作240枚鹌鹑种蛋,孵化出雏34只,孵化率为14.1%;对新出雏鹌鹑解剖后,可检测到喙部、眼部、羽毛、肝脏、肾脏、盲肠、肺脏、小肠、大肠、输卵管、心脏、胸肌及大脑等内脏器官中绿色荧光蛋白广泛性表达,但在性腺中绿色荧光蛋白表达信号较弱;对发育到性成熟期的G0代19只雄性鹌鹑精液基因组聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)检测,其中3只为阳性,阳性率为15.7%(3/19);在3只阳性雄性鹌鹑的236只后代中,有4只经PCR及印迹杂交(Southern-blot)检测为阳性,阳性率为1.69%(4/236)。结果表明:利用慢病毒载体胚盘下腔注射成功生产出转基因鹌鹑,为转基因禽类制备提供了一种简便易行的好方法。