“一箭双星法”构建Flt3转基因细胞株

目的构建稳定表达Flt3分子的转基因细胞株。方法将Flt3基因重组入逆转录病毒载体pEGZ-term,通过293T细胞的包装获得具有感染能力的完整重组病毒载体,进而采用“一箭双星法”即同时感染BaF和L929细胞,构建Flt3转基因细胞株。结果成功获得稳定表达Flt3的转基因细胞株BaF/Flt3和L/Flt3。结论采用“一箭双星法”成功构建Flt3转基因细胞株,为以Flt3为靶分子的研究奠定了物质基础,也为类似的高难度的转基因细胞株的构建提供了有价值的经验。

转MSTN干扰载体细胞株的获得及外源基因整合情况的研究

转基因细胞株的建立能够为转基因体细胞克隆技术奠定重要基础。该实验利用MSTN干扰载体,转染鲁西黄牛胎儿成纤维细胞,获得5个相应的转基因单克隆细胞株。采用Realtime PCR和高效热不对称互交式PCR(hiTAIL-PCR)技术检测细胞克隆中MSTN表达载体的拷贝数及其在牛基因组中的整合位点。结果表明,荧光定量PCR有效检测到5个细胞克隆中质粒的拷贝数分别为2.26±0.32、1.52±0.25、25.68±1.02、8.43±0.73和6.72±0.10。hiTAIL-PCR对整合位点的检测结果表明,质粒片段在插入到基因组的过程中进行了重组,其与基因组的结点处有2或4个共同的碱基序列。该研究探索MSTN干扰载体在牛胎儿成纤维细胞中的整合机制,以期获得遗传背景清楚的转基因细胞作为体细胞核移植的重要材料,为高产转基因肉牛新品种的培育提供重要的理论和实验基础。

一种检测线粒体核酸酶靶向剪切活性的新方法

旨在建立一种简便检测线粒体DNA(mt DNA)核酸酶靶向剪切活性的方法。利用转基因技术,将一段含有两个靶向目标序列(T1、T2)的线粒体DNA序列随机整合到宿主基因组中,通过实时荧光定量PCR筛选单拷贝或低拷贝的单克隆转基因细胞株。将含有T1、T2的CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas9质粒分别瞬时转染到所选细胞株中,靶向剪切核基因组,在靶向目标序列处造成DNA双链断裂,引发非同源末端连接修复机制,引入插入或缺失突变。观察测序峰图,证明两个靶向目标序列T1、T2均有剪切效率,且T1高于T2。建立了一种高效快速检测线粒体核酸酶靶向剪切活性的新方法。

靶细胞表面HCV受体分子排列顺序对病毒入侵影响的研究

目的通过在小鼠肝癌细胞表面串联表达HCV受体分子,在二维结构的基础上研究HCV受体分子的排列顺序对病毒入侵的影响,为研究HCV的早期感染机制奠定基础。方法将已构建的慢病毒表达载体p CDHh LDLR-h SR-BⅠ-h CD81-GFP、p CDH-h LDLR-h CD81-h SR-BⅠ和p CDH-h CLDN-1-h OCLN-DsRed与包装质粒共转染包装细胞293FT,包装慢病毒,用收集浓缩的慢病毒攻击小鼠肝癌细胞系Hepa1-6,抗生素G418加压筛选得到串联表达人紧密链接区域分子CLDN-1和OCLN的转基因细胞株h CLDN-1-OCLN/Hepa1-6(CO/Hepa1-6);重组慢病毒p CDHh LDLR-h SR-BⅠ-h CD81-GFP和p CDH-h LDLR-h CD81-h SR-BⅠ攻击转基因细胞株CO/Hepa1-6,通过嘌罗霉素puro和G418双抗加压及流式细胞术,最终筛选获得5种分子h LDLR、h SR-BⅠ、h CD81、h CLDN-1和h OCLN共表达且具有不同受体排列顺序的转基因人源化小鼠肝癌细胞株LSCCO/Hepa1-6和LCSCO/Hepa1-6;利用HCV阳性血清直接感染方法分析LSCCO/Hepa1-6和LCSCO/Hepa1-6对HCV的易感性,研究HCV受体分子的排列顺序对病毒入侵的影响。结果两种细胞株LSCCO/Hepa1-6和LCSCO/Hepa1-6对HCV结合均有增加,但LSCCO/Hepa1-6细胞株细胞表面的HCV受体排列顺序更有利于HCV入侵。结论在二维结构的基础上,HCV在感染早期要优先与B族Ⅰ型清道夫受体SR-BⅠ作用。