美发现胡蜂转基因蛋白可保护植物

AgBiotech Reporter 2003年20卷7期6页报道：美国肯塔基大学昆虫学系的科学家Bruce Webb和美国肯塔基烟草研究和开发中心（KTRDC）的科学家Indu Maiti最近的研究证明，寄生胡蜂可在昆虫宿主例如鳞翅目幼虫体上产卵，并将一种称为畸形细胞（Teratocyte）的特化细胞释入昆虫宿主体内。还发现畸形细胞可在昆虫宿主体内释放出一种蛋白，使昆虫宿主发生麻痹，从而使胡蜂的幼虫可以安全地摄食昆虫宿主。

美国利用转基因蛋白质抑制流感病毒传播

流感病毒经过遗传漂变会周期性地变得更具毒性，严重威胁全球公共健康。通常，抵抗新流感菌株的疫苗需要数月的时间完成开发、测试和生产等环节，同时它们对已患流感者毫无作用。因此，当致命性流感突然出现和快速传播时，疫苗的研制和发送所造成的长时间延误让人们束手无策，而人们缺乏免疫能力又加速了流感病毒在公众间的传播。

基于BDNF/TrkB通路探讨清心开窍方对APP/PS1双转基因小鼠学习记忆能力的影响

目的 基于脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)/原肌球蛋白相关激酶B(Tropomyosin-related kinase B,TrkB)通路探讨清心开窍方对淀粉样前体蛋白/早老素-1(APP/PS1)双转基因小鼠认知功能及神经元保护作用的影响。方法 将30只APP/PS1小鼠按照随机数字表法分为模型组、安理申组(1.67 mg·kg^(-1)·d^(-1))、清心开窍方低剂量组(4.75 mg·kg^(-1)·d^(-1))、清心开窍方中剂量组(9.5 mg·kg^(-1)·d^(-1))和清心开窍方高剂量组(19 mg·kg^(-1)·d^(-1))。选取6只雄性C57/B6小鼠记为对照组,连续90 d于每日上午9点进行灌胃。完成灌胃后,通过Morris水迷宫测试小鼠的空间学习记忆能力;通过HE染色观察小鼠海马CA1区细胞形态变化;通过尼氏染色观察小鼠海马CA1区病理形态变化;通过实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测β位淀粉样前体蛋白裂解酶1(BACE1)、TrkB、BDNF mRNA在小鼠海马中的表达;通过蛋白免疫印迹法(Western blotting, WB)检测P-TrkB、TrkB、BACE1、BDNF蛋白的表达水平。结果 与对照组相比,模型组小鼠逃避潜伏期明显增多(P<0.01),而穿越平台次数以及在原平台所在象限滞留的时间明显增多(P<0.01),其小鼠海马神经元出现严重损伤,排列松散,尼氏体数量减少,染色变浅,BACE1表达增加(P<0.01),P-TrkB、TrkB、BDNF表达降低(P<0.01);与模型组相比,清心开窍方治疗组逃避潜伏期缩短,穿越平台次数以及目标象限停留时间明显增多(P<0.05或P<0.01),小鼠海马锥体细胞排列较紧密,形态完整,尼氏体数目增加,着色加深,BACE1表达降低(P<0.05或P<0.01),P-TrkB、TrkB、BDNF表达增加(P<0.05或P<0.01)。结论 清心开窍方可能通过BDNF/TrkB通路改善APP/PS1小鼠学习记忆能力,对神经细胞起保护作用。

CP4-EPSPS转基因蛋白的适体筛选与亲和性分析

目的:通过筛选获得CP4-EPSPS转基因蛋白的最优适体,为应用于检测作准备。方法:体外合成长度为78个碱基的随机ssDNA文库,应用指数富集配基的系统进化(SELEX)技术,以CP4-EPSPS转基因蛋白为靶目标进行15轮筛选,将筛选到的适体群进行克隆、测序,用DNAMAN软件对每个适体的保守序列和二级结构进行分析并应用生物素-抗地高辛碱性磷酸酶显色系统进行亲和性分析。结果:成功获得靶目标的最优适体,即D04号适体,结合率最高(2.2745)为最低的5.9倍。结论:筛选流程合理、可行,实验结果较理想。

绿色荧光蛋白转基因小鼠的生理生化常数

目的测定绿色荧光蛋白转基因小鼠不同年龄段的生理生化、组织病理学等方面的指标,为该品种转基因小鼠应用于毒理学等领域研究提供理论依据。方法定期测定不同周龄段(4～6周龄,6～8周龄,9～12周龄,13～14周龄)141只绿色荧光蛋白转基因(GFP)小鼠和100只对照组C57BL/6J小鼠的体重和摄食量,对上述两种动物定期取血,测定血生化及血液学指标,对动物进行大体解剖,计算主要脏器(心、肝、脾、肺、肾、脑、胸腺,性腺)的脏器系数并进行组织病理学检测。结果①体重和摄食量:4周龄的GFP小鼠,其体重明显低于对照组,差异具有显著性(P<0.01);4～5周龄的GFP小鼠,其摄食量明显高于对照组,差异具有显著性(P<0.01)。②血常规测定:6～8周龄,9～12周龄的GFP小鼠,其红细胞计数(RBC)明显低于对照组,差异具有显著性(P<0.01);9～12周龄,13～14周龄的GFP小鼠,其白细胞计数(WBC)明显高于对照组,差异具有显著性(P<0.01)。③血生化测定:6～8周龄,9～12周龄,13～14周龄的GFP小鼠,其尿酸(UA)值明显高于对照组,差异具有显著性(P<0.01);6～8周龄,9～12周龄的GFP小鼠,其总蛋白(TP),白蛋白(ALB)明显低于对照组,差异具有显著性(P<0.01)。④脏器系数:6～8周龄,9～12周龄的GFP小鼠,其胸腺的脏器系数明显低于对照组,差异具有显著性(P<0.01);9～12周龄,13～14周龄的GFP小鼠,其肝脏的脏器系数明显高于对照组,差异具有显著性(P<0.01)。⑤病理检测:6～8周龄有部分GFP小鼠胸腺发育不良,其他受检脏器和其他年龄段动物未见明显病理改变。结论①绿色荧光蛋白转基因小鼠与对照组C57BL/6J小鼠相比,在体重(4周龄)、摄食量(4～5周龄)、血常规(红细胞计数RBC、白细胞计数WBC、血红蛋白HGB)、血生化(尿酸UA、总蛋白TP、白蛋白ALB)、脏器系数(胸腺,肝脏)等指标上存在明显差异,但是其值均在正常范围内。②绿色荧光蛋白转基因小鼠在6～8周龄有部分小鼠胸腺发育不良。

淀粉样前体蛋白转基因痴呆模型小鼠视网膜和视神经纤维层病理改变

目的观察淀粉样前体蛋白(amyloid precusor protein,APP)转基因痴呆(Alzheimer’s disease,AD)模型小鼠视网膜组织病理和视神经纤维记数的改变。方法本实验采用6只10月龄的C57BL/6JAPP转基因雄性小鼠模型作为模型组,6只同月龄的C57BL/6J正常雄性小鼠作为正常对照组。处死小鼠,完整取出眼球分离视网膜,进行视网膜常规HE染色,同时取球后视神经制作半薄切片,甲苯胺蓝染色,光镜观察视神经形态,行图像分析和轴突纤维计数。结果视神经横断面模型组小鼠与正常对照组相比:神经纤维组织疏松,排列较紊乱,染色深浅不均,间质增多,部分轴突水肿。与正常对照组(1.77±0.04)×106相比,模型组小鼠视神经纤维数量(2.28±0.06)×106明显减少,视神经纤维密度正常对照组和模型组分别为(0.3836±0.0697)μm-2和(0.2701±0.0517)μm-2,差异有统计学意义(P<0.01)。模型组神经细胞平均光密度值无明显变化,与正常对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。与正常对照组比较,模型组小鼠视网膜神经节细胞层细胞数量明显减少,差异有统计学意义(P<0.01),两组内颗粒层和外颗粒层细胞数量无明显变化,差异无统计学意义(均为P>0.05)。结论 APP转基因AD模型小鼠视网膜神经节细胞数减少,视神经纤维数明显减少而且受损,提示APP转基因AD模型小鼠视网膜和视神经存在退行性病变。

猪传染性胃肠炎病毒纤突糖蛋白在转基因玉米中的表达

本研究拟构建携带猪传染性胃肠炎病毒纤突糖蛋白基因(TGEV-S)的转基因玉米植株并检测其表达情况。首先利用PCR方法自携带TGEV-S基因的重组质粒中扩增2.2kb的S基因片段,然后插入植物表达载体pBAC176中,该表达载体以编码除草剂草甘膦抗性的EPSP基因作为选择标记,目的基因以双增强子的CaMV35S(E35S)及其玉米Hsp70第一内含子为驱动。以授粉后10～12d约0.5～1mm大小的玉米幼胚为受体,用基因枪进行转化,经过愈伤组织诱导、草甘膦抗性筛选和分化再生培养,先后获得74株转化再生植株。利用PCR和Southern blot检测表明,T0代转基因苗有9株检测结果为阳性。T1代转基因玉米株系经PCR检测有14个转基因株系为阳性,初步确定了目的基因在这些转基因玉米中的稳定整合。进而通过间接ELISA分析初步确定目的基因在7个T1代转基因玉米株系获得了表达。研究结果为进一步研究表达TGEV-S转基因玉米的生物学活性奠定了基础。

人转铁蛋白转基因克隆牛整合位点检测

为检测外源基因整合在转基因克隆牛染色体上的定位情况,通过优化染色体荧光原位杂交技术,成功对4头人转铁蛋白转基因克隆牛的整合位点进行定位。每头牛分析中期分裂相40个以上,杂交率在53.1%～86.8%之间,且杂交信号分别位于转基因克隆牛的11号、15号和19号染色体的相应位置;另外采用定量PCR方法对杂交信号强弱不同的转基因克隆牛个体进行整合位点拷贝数的检测,结果显示拷贝数的多少与杂交信号强弱直接有关。

载脂蛋白C3转基因小鼠应用于严重高三酰甘油血症急性胰腺炎的探索

目的本研究旨在建立严重高三酰甘油血症下的急性胰腺炎小鼠模型。方法采用野生小鼠与载脂蛋白C3(apolipoprotein C3, ApoC3)转基因小鼠,以雨蛙素诱导急性胰腺炎,检测血浆脂质、淀粉酶活性与胰腺病理。并通过抗氧化剂叔丁基-特丁基对苯二酚(terbiary-butylhydroquinone, tBHQ)预防性给药,检测胰腺病理改变。结果 ApoC3转基因小鼠血浆三酰甘油浓度显著升高,在诱发急性胰腺炎后,淀粉酶活性在9 h与12 h时均升高,胰腺病理损伤加重较明显。使用tBHQ并不能改善ApoC3转基因小鼠的胰腺病理损伤。结论 ApoC3转基因小鼠诱导急性胰腺炎后,血浆淀粉酶活性增加,胰腺病理损伤明显加重,与临床中严重高三酰甘油血症-急性胰腺炎患者的胰腺病理改变类似,ApoC3转基因小鼠可以作为探讨严重高三酰甘油血症下急性胰腺炎病理机制研究的动物模型。

淀粉样前体蛋白/早老素1转基因小鼠脑皮质中过氧化物酶体增殖剂激活受体α的表达及意义

目的探讨淀粉样前体蛋白(APP)/早老素1(PS1)转基因小鼠脑皮质中过氧化物酶体增殖剂激活受体α(PPARα)的表达变化及意义。方法选择10只5月龄雄性APP/PS1双转基因C57BL/6J-TgN(APP/PS1)ZLFILAS小鼠为实验组,10只同遗传背景5月龄雄性C57BL/6J野生型小鼠为对照组。采用Morris水迷宫实验测定2组小鼠空间学习记忆能力,免疫组织化学法检测2组小鼠脑组织中β-淀粉样蛋白(Aβ)沉积情况,Western blot法检测2组小鼠脑皮质中PPARα、APP蛋白及肝组织中PPARα、脂酰辅酶A氧化酶1(ACOX1)及肉碱脂酰转移酶1(CPT1)蛋白表达,生物化学法检测2组小鼠血清中三酰甘油(TG)和总胆固醇(TC)水平。结果实验组小鼠不同时间点逃避潜伏期短于对照组,但2组间比较差异无统计学意义(P>0.05);实验组小鼠在目标象限游动时间短于对照组,但2组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。对照组小鼠脑组织中未见到Aβ阳性斑块,实验组小鼠脑皮质和海马区可见大量大小不等的Aβ阳性斑块。实验组小鼠脑皮质中PPARα蛋白相对表达量显著低于对照组,APP蛋白相对表达量显著高于对照组(P<0.05)。实验组小鼠肝组织中PPARα、ACOX1、CPT1蛋白相对表达量显著高于对照组(P<0.05)。实验组小鼠血清TG水平显著高于对照组(P<0.05),实验组与对照组小鼠血清TC水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论APP/PS1转基因小鼠存在脑组织和肝组织PPARα异常表达、脂质代谢紊乱,PPARα在阿尔茨海默病的发病机制中起重要作用。

10月龄淀粉样前体蛋白和早老素双转基因（APP／PS-Tg）小鼠相关指标检测

目的观察10月龄淀粉样前体蛋白（APP）和旱老素（PS）双转基因（APP／PS-Tg）小鼠的各种病理学检测指标，为后续阿尔茨海默病（AD）研究提供参考。方法①用自主活动试验和水迷宫试验观察行为学改变；②用HE染色、硫代黄素s染色和TUNEL荧光染色观察脑组织病理学改变、纤维状AB沉积和细胞凋亡；③用多重荧光检测系统对血清和脑组织匀浆进行与免疫调节和信号通路有关的细胞因子检测。结果①行为学试验中，10月龄APP／PS-Tg小鼠自主活动次数与阴性对照比较差异无统计学意义，但Morris水迷宫试验显示APP／PS-Tg小鼠学习认知的时间（即潜伏期）落后于阴性对照组。②脑组织切片HE染色，可见APP／PS-Tg小鼠大脑皮层和海马区可见散在老年斑病变。老年斑大小不一，部分老年斑周围可见不典型的小胶质细胞反应，而阴性对照无此病理改变。用硫代黄素S染色，在激光共聚焦显微镜下用波长429nm观察，APP／PS-Tg小鼠大脑皮层和海马区可见散在颗粒状绿色荧光，荧光颗粒大小不一，主要分布在大脑皮层，海马区数量较少。阴性对照小鼠大脑皮层和海马区未发现有荧光颗粒。用TUNEL试验检测脑内细胞凋亡情况，在激光共聚焦显微镜下在520士20nm的荧光下观察绿色荧光标记的凋亡细胞。APP／PS-Tg小鼠与阴性对照比较，差异有极显著统计学意义沪≤0．01）。③血清细胞因子检测，10月龄APP/PS-Tg小鼠与阴性对照组比较，白介素（IL）-2、IL-10、IL-12、IL-12、IL—17α、肿瘤坏死因子（TNF）-α和转化生长因子㈣B3含量明显下降，其中IL-2、／L-10、IL-17α和TNFα含量均有显著下降沪≤0．01）；用脑组织匀浆检测细胞因子，APP／PS—Tg小鼠IL-2、IL-17α、TNF-α和TGβ1，2，3的含量较阴性对照高，但差异无统计学意义（P≥0．05）。结论在APP-PS-Tg小鼠的评价指标中，Morris水迷宫试验是一个敏感可靠的行为学试验方法；脑组织切片HE染色、硫代黄素S染色和TUNEL试验均简单易行，可从不同角度检测APP／PS—Tg小鼠的脑内病理改变；血清和脑组织匀浆细胞因子的检测显示有些细胞因子可能参与阿尔茨海默病的发病过程。

绿色荧光蛋白转基因雄鼠肝细胞移植重建雌鼠的造血功能研究

目的用荧光雄鼠的肝细胞回输半致死量射线照射的C57BL雌鼠,观察肝细胞是否有重建造血功能的作用。方法用荧光雄鼠的肝细胞回输给半致死量射线照射的C57BL雌鼠,在移植后18、39和53 d剪鼠尾,采血并用CD4-PE和CD8-PE标记,再用氯化铵溶血,上流式细胞仪检测。移植87 d后杀鼠取骨髓用荧光原位杂交检测Y染色体阳性细胞的百分比,并取外周血、脾细胞、肝细胞和骨髓细胞检测绿色荧光蛋白(GFP)阳性细胞的百分比。结果回输肝细胞的雌鼠外周血中检测到GFP阳性细胞,同时检测到一部分GFP阳性细胞转化成了CD4+或CD8+T细胞,外周血中GFP阳性细胞的比例与荧光原位杂交分析的骨髓中的Y染色体阳性比例呈正相关。同时在鼠的脾细胞、肝细胞和骨髓细胞中都检测到了GFP阳性细胞。而脾细胞中检测到的GFP阳性细胞百分比高于其他细胞,相比有统计学意义(P=0.003)。结论成年鼠肝细胞含有一定量的造血干细胞,在移植鼠体内存活并分布在多脏器,重建了雌鼠的造血功能。

白藜芦醇改善α-突触核蛋白A53T转基因小鼠运动功能障碍和调节外周免疫的作用研究

目的研究白藜芦醇(resveratrol,RES)对α-突触核蛋白(α-synuclein,α-Syn)A53T转基因小鼠运动功能障碍及外周免疫的影响。方法选取8月龄的A53T转基因小鼠,随机分成4组:对照组(WT)、对照治疗组(WT+RES)、模型组(PD)、模型治疗组(PD+RES)。治疗组每3 d灌胃RES,用药3个月;对照组和模型组给予等量生理盐水。通过爬杆实验、转棒实验、前脚抓力实验、四肢抱紧实验检测各组小鼠运动水平。流式细胞仪检测小鼠T淋巴细胞亚群,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测小鼠血清中白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-18(IL-18)以及转化生长因子-β(TGF-β)的水平。结果与对照组相比,模型组运动功能评分均较低;与模型组相比,模型治疗组运动功能评价显著改善。流式结果显示,与对照组比,模型组小鼠外周T细胞占比、CD4^(+)T细胞占比、CD4^(+)/CD8^(+)比值均降低,CD8^(+)T细胞占比无统计学意义。与模型组相比,模型治疗组T淋巴细胞占比和CD4^(+)T细胞占比均显著升高,有统计学意义,CD4^(+)/CD8^(+)比值也升高,但差异无统计学意义。外周血血清ELISA结果显示,与对照组相比,模型组小鼠IL-6、IL-18均升高,TGF-β降低,TNF-α浓度无统计学差异。与模型组相比,模型治疗组IL-6、IL-18浓度显著下降,TGF-β有所上升,结果无统计学意义。结论RES通过调节小鼠外周免疫,减少神经炎症反应,从而显著改善A53T转基因小鼠的运动功能障碍。

转基因植物蛋白有助于治疗自身免疫性疾病

据伦敦的研究人员报道,转基因植物有可能成为治疗各种自身免疫性疾病的蛋白质来源。对自身免疫性疾病和排异反应来说,有些植物甚至可被用作可食用治疗方法。更重要的是能对一些植物进行设计,因此,这些植物产生的蛋白质非常贵重,而从其他途径尤其难以得到。伦敦卫生科学中心移植和免疫生物学组的肾病学家Anthony Tevnikar目前正与农业方面的研究人员进行合作。

GFP转基因小鼠骨髓间充质干细胞纯化方法的研究

目的：应用两种不同方法培养纯化绿荧光蛋白（GFP）转基因小鼠骨髓间充质干细胞,以探求提高GFP小鼠骨髓间充质干细胞纯化效率的方法。方法：取4~6周龄GFP小鼠股骨全骨髓,采用贴壁法进行体外培养。待细胞融合至约80%,将细胞分为两组,分别采用常规法和改良法进行消化传代。荧光显微镜下观察各组细胞荧光状态及形态学特征,MTT法绘制细胞生长曲线,流式细胞术检测细胞表面标志物及绿荧光蛋白表达率,体外诱导观察其成骨、成脂能力。结果：贴壁法获得数量较多,形态多样的原代细胞。随着传代次数的增加,细胞形态一致性不断增高。与传统方法相比,改良法在不影响细胞增殖、分化潜能,不影响其GFP表达率的前提下,可以更早获得纯度较高的细胞。结论：改良法可提高纯化小鼠骨髓间充质干细胞效率,为其用于进一步研究工作提供基础。

Nestin-GFP转基因小鼠睾丸中P75NTR表达的研究

目的:观察小鼠睾丸中的p75神经营养因子受体(P75NTR)的表达规律,并探讨其与巢蛋白(nestin)之间的关系。方法:通过免疫荧光技术观察出生后第5天Nestin-GFP转基因小鼠睾丸组织中的P75NTR和巢蛋白的表达位置,并采用实时荧光定量PCR和流式细胞分选方法检测P75NTR在不同周龄小鼠睾丸组织中的表达量;对分选得到的P75NTR阳性细胞在神经干细胞的培养液中进行培养,通过定向分化技术观察其神经分化能力。结果:免疫荧光染色结果显示P75NTR和巢蛋白定位表达于睾丸间质细胞。实时荧光定量PCR和流式细胞分选结果显示,P75NTR在出生第14天小鼠睾丸组织中出现表达高峰。出生后第5、14、30天小鼠睾丸中P75NTR阳性百分率分别为(2.88±0.52)%、(9.54±1.81)%、(2.63±0.43)%,分选得到的P75NTR阳性细胞也共定位表达巢蛋白和P75NTR,并且具有神经分化能力。结论:睾丸组织中P75NTR和巢蛋白共定位表达于睾丸间质细胞,该类P75NTR阳性细胞具有神经分化能力,推测其起源于神经脊。