昆虫转基因载体——piggyBac转座子

piggyBac转座子在分类上属于真核生物的第二类转座子 ,是一个自主因子 ,长 2 4 76bp ,有短的末端反向重复序列 (ITR)和一个可读编码框 (ORF) ,ITR长 1 3bp ,ORF长 2 1kb。piggyBac转座子可以在基因组中切出和转座 ,切出和转座总是发生在特征性的TTAA四核苷酸目标位点序列 ,转座频率较高 ,而且piggyBac转座子受生物体种类的限制性较少。利用piggyBac转座子构成的载体———辅助质粒系统已成功地获得了转基因地中海果蝇、黑腹果蝇和家蚕。

转基因载体聚乙二醇-聚谷氨酸纳米微球的制备

目的 制备聚乙二醇 聚谷氨酸两嵌段共聚物 (PEG PBLG )纳米微球并观察其转基因能力。方法 合成两亲嵌段共聚物PEG PBLG ,红外光谱 (IR)、核磁共振谱 ( 1H NMR )、凝胶渗透色谱法 (GPC)测定其组成和结构 ;乳化溶剂蒸发法制备DNA/PEG PBLG纳米微球 ,透射电镜观察其形态 ,DNaseⅠ消化实验测试其DNA保护能力 ,以GFP为报告基因转染Tca8113细胞观察其转基因能力。结果 IR图谱证实两嵌段共聚物的形成 ,GPC和1H NMR测定PEG PBLG分子量约 80 0 0 ,PEG PBLG纳米微球直径约 70nm ,对质粒DNA有较好的保护作用并有较强转基因能力。结论 成功制备两亲嵌段共聚物PEG PBLG纳米微球并证实其载基因能力 。

肝脏特异性表达人遗传印记基因PEG10转基因载体的构建和鉴定

目的构建小鼠肝脏特异性表达人遗传印记基因PEG10的转基因载体pALB-PEG10-EGFP,为制备转基因小鼠做准备。方法RT-PCR扩增PEG10基因cDNA序列,克隆入T载体进行酶切、测序鉴定,后将其定向克隆至真核表达载体pALB-EGFP中ALB的下游,构建转基因载体pALB-PEG10-EGFP;在Lipofectamine介导下转染L02细胞,经G418抗性筛选,挑选阳性克隆并扩大培养;采用RT-PCR、Western blot、免疫细胞化学等方法分析PEG10在L02细胞中的表达和细胞内定位。结果酶切和测序结果表明pALB-PEG10-EGFP构建成功;稳定转染后的L02表达有PEG10的mRNA及蛋白,且主要定位于胞浆。结论重组体pALB-PEG10-EGFP的构建初步奠定了转基因小鼠制备的基础。

甘丙肽重构基因GAL(intronⅡ)的克隆及其过表达转基因载体的构建

目的克隆甘丙肽重构基因GAL(intronⅡ),构建小鼠神经系统特异性表达甘丙肽(galanin,GAL)的转基因载体pUC18/PDGF-β-promoter/GAL(intronⅡ),为制备GAL转基因小鼠做准备。方法通过常规PCR、RT-PCR及重叠延伸PCR(overlap extension PCR,OE-PCR)扩增出插入GAL第二内含子的GAL全长cDNA的重构基因GAL(intronⅡ),将GAL(intronⅡ)克隆入T载体进行酶切、测序鉴定;同时从psisCAT6α中切下血小板源性生长因子β链(platelet-derived growth factor beta polypeptide,PDGF-β)启动子片段连接到空载体pUC18上构建出重组载体pUC18/PDGF-β-promoter;然后将GAL(intronⅡ)定向克隆于pUC18/PDGF-β-promoter下游,构建转基因载体pUC18/PDGF-β-promoter/GAL(intronⅡ)。结果 PCR和限制性内切酶分析鉴定,表明获得转基因载体pUC18/PDGF-β-promoter/GAL(intronⅡ)。通过对重构基因GAL(intronⅡ)的GALcDNA和第二内含子序列测序证实其与GenBank中的标准序列一致,GAL(intronⅡ)中第二内含子插入的位置准确,且无移码。结论使用重叠延伸PCR扩增重构基因GAL(intronⅡ)并成功构建转基因载体pUC18/PDGF-β-promoter/GAL(intronⅡ),为转基因小鼠制备奠定一定的实验基础。

针对小鼠Chmp1b基因的可诱导shRNA表达转基因载体的构建及功能鉴定

目的设计构建针对小鼠Chmp1b基因的可诱导shRNA表达转基因载体,以用于制备相关转基因小鼠,并在体外验证其有效性。方法剔除pc DNA3.1载体的CMV启动子以及多克隆位点,然后接入带有LacZ-fLoxP插入失活的小鼠U6启动子并引入适当的酶切位点,装入设计好的shRNA片段,测试shRNA抑制Chmp1b表达的效率与专一性,检查Cre重组酶介导位点特异性重组去除LoxP位点之间的lac基因后U6启动子活性恢复情况。结果设计的shRNA片段可明显降低Chmp1b的表达,抑制效率达90%以上;成功构建针对小鼠Chmp1b基因的可诱导shRNA表达转基因载体,插入U6启动子中的LacZ-fLoxP片段既可以控制U6启动子活性又可以起到报告基因的作用。结论针对小鼠Chmp1b基因的可诱导shRNA表达转基因载体可以用于制备相关转基因小鼠。

与排异反应相关基因克隆及其反义转基因载体构建

目的克隆与排异反应密切相关的iNOS基因cDNA片段,并构建反义转基因载体。方法培养人血管内皮细胞HVEC细胞株,采用反转录-PCR方法获取iNOS cDNA基因片段,并克隆入T载体并进行序列分析。用HindIII与BamHI双酶切带有iNOS cDNA片段的T载体质粒与pCDNA5载体,回收酶切产物,连接,转化,提取质粒并酶切鉴定。结果RT-PCR获取了669bp的iNOS基因片段;序列分析表明克隆的iNOS片段序列正确;双酶切分析显示克隆入pCDNA3载体的iNOS基因片段与预期的大小一致。结论克隆了iNOS基因片段,并构建了iNOS的反义转基因载体。

对精子作为动物转基因载体的探讨

精子作为基因的载体制作转基因动物,以其简单、高速和广泛适用等特点而吸引众多的研究小组在不同水平上进行研究。本文就他们的研究成果作一系统综述。

阳离子多聚物转基因载体的研究进展

综述阳离子多聚物作为非病毒载体的研究现状。同时阐述阳离子多聚物转基因载体与脂质体、病毒载体的联合应用。

壳聚糖基非病毒转基因载体的研究进展

高效的转基因载体是基因释放系统的核心。作为一种天然碱性多糖 ,壳聚糖具有良好的生物相容性、耐血清性和独特的跨细胞膜特性。

pBR002-HLA-DRB1＊ 0803转基因载体构建、表达及其抗原递呈功能研究

目的构建可以表达人类HLA-DRB1*0803的转基因载体,并在细胞水平验证其表达及抗原递呈功能。方法提取人WATANABE细胞株(基因型为HLA-DRB1*0803纯合子)的总RNA,RTPCR扩增DRB1*0803基因片段,与小鼠Eαpromoter和兔β-globin基因内含子序列同时导入p BR002-lacz载体。pBR002-HLA-DRB1*0803转基因载体转染小鼠DCS细胞和B细胞系,用Western blot和免疫荧光的方法对HLA-DRB1蛋白进行检测。流式细胞术检测转染小鼠DCS细胞对HBc Ag特异性CD4+T细胞的刺激和极化效应。结果经双酶切和测序验证,成功构建了p BR002-HLA-DRB1*0803转基因载体;转染载体后的小鼠DCS细胞和B细胞系均表达出了大小约为29×10~3的HLA-DRB1蛋白;免疫荧光结果表明HLA-DRB1蛋白主要表达于细胞质内。转染后的小鼠DCS细胞可将负载的HBcAg递呈给HLA-DRB1*0803阳性基因型的人CD4^+T细胞,产生明显的CD4^+T细胞应答。结论成功构建了HLA-DRB1*0803转基因载体,该载体可以在细胞水平特异性表达HLA-DRB1蛋白,并具有HLADRB1*0803特异性抗原递呈功能。

通用型动物转基因载体的构建及验证

为了构建通用型动物转基因载体,以pBluescriptⅡKS+为基础,根据标记基因所含酶切位点,设计改造多克隆位点,插入从pTARGET载体中扩增的SV40启动子及新霉素磷酸转移酶基因(Neo),其下游插入共表达序列、增强型绿色荧光蛋白质基因(EGFP)及SV40 poly A,并在SV40启动子上游和SV40 poly A下游各添加一个同向的LoxP位点,构建成通用载体pNIGFP,标记基因上游拥有Xho I、Sal I、SacⅡ多克隆位点,下游拥有Nhe I、Cla I、Sac I位点。酶切鉴定和测序表明pNIGFP构建正确。pNIGFP脂质体法转染山羊胎儿成纤维细胞,荧光显微镜下观察到EGFP高表达。遗传霉素(G418)筛选表明,Neo基因表达正常,山羊胎儿成纤维细胞的最适筛选浓度为600"g/ml。pNIGFP可利用G418进行抗性筛选,还可通过EGFP表达对外源基因的整合进行实时跟踪,另外,该载体具有LoxP位点,外源基因整合后可用Cre重组酶去除标记基因,具有高效、方便、安全的特点。

三种EB病毒潜伏膜蛋白基因转基因载体的构建

为制备ＥＢ病毒潜伏膜蛋白（ＬＭＰ）基因转基因小鼠，探讨ＬＭＰ的体内致瘤作用，本文构建了三种不同的ＬＭＰ基因转基因载体，即ｐＢＲ３２２ＭＴＬＭＰ，ｐＭｃｉ３ＬＭＰ和ｐＭＶＬＭＰｃｍｙｃ；

抗生素对转基因载体农杆菌的影响

研究了抗生素类药物对转基因载体农杆菌的影响，结果表明各类抗生素都能杀死或抑制农杆菌。其中以亚力希和氧氟沙星的作用最强，而较低浓度（１２５毫克／升）的吉他霉素和青霉素钠的作用较差。

北柴胡UGT基因的克隆及其过量表达和RNAi转基因载体的构建

目的:克隆北柴胡中可能参与柴胡皂苷生物合成的UGT基因,构建其过表达和抑制表达的转基因载体,为通过转基因验证其功能奠定基础。方法:在454高通量测序已获得部分cDNA序列基础上,通过RACE和LD-PCR方法扩增全长cDNA克隆。设计含有酶切位点的PCR引物,PCR扩增UGT基因的ORF和部分片段后,酶切,分别插入到pCAMBIA-SUPER1 300和pHANNIBAL中。重组的pHANNIBAL经Not I酶切后插入到pART27中。最终以构建出过表达和抑制表达的转基因载体。结果:扩增到了北柴胡1个UGT基因全长cDNA克隆,构建了这一基因的过表达和抑制表达转基因载体。结论:通过UGT基因的全长cDNA克隆和转基因载体构建,为后续开展转基因研究,验证其生物功能奠定了基础。

以精子载体法制备转基因小鼠的初步研究

将外源融合基因 BαLA-HI与 DOSPER脂质体等比例混合 ,加入获能精子悬液中 ,37℃、5% CO2 共培养 0 .5h.以这种处理精子作为转基因载体进行小鼠的体外受精及胚胎移植 .在获得的 4 0只移植后代中 ,经 PCR特异片段扩增和 Southern杂交 ,共检测出 2只呈阳性的转基因小鼠 .证明人胰岛素基因已在小鼠染色体上实现了整合 .基因整合率为 5% .

两种转基因载体对关节软骨细胞中内参基因转录水平的影响

目的探讨质粒型和腺相关病毒两种转基因载体对家兔关节软骨细胞中GAPDH、B2M、18S rRNA和TUBB内参基因mRNA转录水平的影响。方法将携带增强型绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein,EFGP)报告基因的质粒型载体pcDNA6.2-EGFP和腺相关病毒载体AAV2-EGFP分别转染至体外培养的家兔关节软骨细胞中,荧光显微镜观测转染后关节软骨细胞中EGFP的表达,实时PCR技术检测两各组关节软骨细胞中GAPDH、B2M、18S rRNA和TUBB基因mRNA转录水平的变化。结果转染48 h后,两组转基因关节软骨细胞中均可见明显的绿色荧光;与正常对照组相比,4个内参基因在两组转基因细胞内的转录水平均下调,其中GAPDH和TUBB基因下调较小,腺相关病毒载体对转基因的影响最小。结论腺相关病毒载体对关节软骨细胞中内参基因表达的影响低于质粒型载体,表明腺相关病毒对关节软骨细胞本身影响较小;GAPDH和TUBB基因可作为实验的内参基因校正目的基因的表达量。

聚乙二醇在非病毒转基因载体中的应用

非病毒转基因载体在基因治疗领域的应用日趋广泛,但目前开发的非病毒转基因载体直接体内应用由于存在诸多问题而受到限制。受药物和蛋白质聚乙二醇化后能增加目的药物和蛋白质稳定性,延长体内半衰期,降低毒副作用等效应的启发,近年有许多研究将聚乙二醇化应用于非病毒转基因载体,取得了一定的效果。

核酶转基因载体的构建及在烟草原生质体中对TMV感染的抑制作用

设计切割烟草花叶病毒RNA的锤头型核酸Rz－2，分别以pKyLx7和pBin19为载体，构建含Rz－2基因及核酸和底物连接的RzSb－2基因的重组质粒，通过三亲交配将目的基因转入土壤农杆菌中的Ti质粒．重组Ti质粒通过PEG法转化烟草原生质体，同时对转化的原生质体接种TMVc一定时间后以半叶法检测原生质体中病毒的侵染性．结果表明转基因原生质体中TMV侵染性明显低于未转基因的对照，推测病毒在转基因的原生质体中复制受到干扰；且核酸Rz－2（正向）表达后作用最为明显，核酸连底物RzSb－2（正向）与RzSb～2（反向）之间有明显差别．

DNA转座子异源活性的大规模调查揭示其功能多样性并扩展基因工程工具箱

自1948年美国科学家Barbara McClintock首次报道转座子以来[1],这类跳跃遗传元件对宿主演化的重要意义逐渐被揭示[2~5]。其中,DNA转座子作为主要类型之一,长期以来备受关注。然而,由于以往多为个案研究,DNA转座子活性的决定因素与进化模式的一般规律尚不清晰。尽管DNA转座子可作为基因工程工具用于插入诱变或转基因载体[6,7],但目前只有Sleeping Beauty(SB)等少数几种转座子得到了开发和广泛应用。因此,系统挖掘具有不同功能特点的转座子工具的工作亟待开展[8]。