利用Cre/lox定位重组系统获得无选择标记GFP转基因烟草

【目的】利用Cre/lox系统具有的特异重组特性,以绿色荧光蛋白GFP为目的基因,获得无选择标记的GFP转基因烟草。【方法】将Bar基因表达盒置于两个同向lox位点之间并与GFP基因表达盒融合后获得相应植物表达载体,转化烟草后获得抗除草剂Basta的GFP转基因植株。GFP转基因植株叶盘二次转化导入重组酶Cre基因后,实现与GFP基因连锁的Bar基因表达盒剔除,剔除Bar基因的植株开花后自交使重组酶Cre基因分离,获得无选择标记的GFP转基因烟草。【结果】将含Bar基因表达盒以及GFP基因表达盒的植物表达载体转化烟草Wisconsin38后获得了抗除草剂Basta以及GFP荧光表达的转基因植株。随机抽取5株转基因植株二次转化导入Cre基因,所获得的再生植株叶盘进行Basta的抗性检测,绝大多数单株对应叶盘在含8mg·L-1PPT(phosphinothricin)的筛选培养基上无法再生死亡,删除效率在76%～100%。对Bar基因删除后区域片段进行克隆测序分析显示,Bar基因表达盒已经被精确删除。Bar基因删除植株开花后自交,获得的自交后代进行NPTⅡ抗性检测,NPTⅡ敏感植株分子检测显示均只含有GFP基因。【结论】利用Cre/lox系统获得烟草无选择标记的转基因植物是稳定可行的,可广泛应用于其它无选择标记转基因植物的培育。

低磷条件下过表达OsPHF1基因对粳稻农艺性状的影响

【目的】磷酸盐转运体运输协助因子(PHF1)通过转录后调节特定磷转运蛋白,影响磷酸盐的利用效率。本研究通过培育过表达OsPHF1的无选择标记转基因粳稻空育131,研究在不同磷浓度环境中OsPHF1的过表达对粳稻空育131产量的影响,为培育可商品化的磷高效转基因水稻品种提供依据。【方法】利用双T-DNA方法构建OsPHF1的过表达载体,通过农杆菌侵染法和后续筛选获得了无选择标记的转基因空育131纯合株系,通过对T_3和T_4代转基因植株的田间试验,研究转基因品系在低磷浓度(75或112.5 kg/hm^2过磷酸钙)、中低磷浓度(225或300 kg/hm^2过磷酸钙)和正常磷浓度(450 kg/hm^2过磷酸钙)下的农艺性状。【结果】获得了3个无筛选标记的纯合OsPHF1过表达转基因空育131株系F18-18、F22-32和F25-6。其中,F22-32和F25-6的OsPHF1的表达量远高于野生型。大田试验显示,F22-32和F25-6株系的T_3代在中低磷(300kg/hm^2过磷酸钙)环境中,分蘖数比对照分别增加了55%和25%,增产幅度分别为38%和34%;F22-32和F25-6株系T_4代在低磷条件下(112.5kg/hm^2过磷酸钙)产量的增幅最大,增产了30%～35%;在中低磷条件下(225 kg/hm^2过磷酸钙)分蘖数和产量也有明显增加。【结论】双T-DNA法能用于培育过表达OsPHF1的无筛选标记转基因水稻。田间试验显示,高表达OsPHF1的转基因株系在中低磷条件下(112.5、225或300 kg/hm^2过磷酸钙)分蘖数和产量稳定增加。

无选择标记转基因大白菜的检测

通过对转基因大白菜进行TuMV-C4病毒摩擦接种鉴定、ELSIA检测、提取转基因大白菜DNA进行PCR检测,并通过PCR-Southern杂交、RT-PCR检测转基因大白菜,构建了针对无选择标记转基因大白菜的系统检测方法。试验结果表明:转基因大白菜通过摩擦接种TuMV-C4病毒抗病性鉴定,188株表现为抗性,初步筛选率为19.46%;进行ELISA检测抗病植株中TuMV含量,有63株明显低于非转化植株,筛选率达到26.25%;对抗TuMV植株直接进行目的基因PCR检测,有25株呈阳性,筛选率达到13.30%。经PCR-Southern杂交检测和RT-PCR检测,表明转基因大白菜中不仅整合了Nib基因,而且获得了表达。这种逐级递进的检测系统可以高效地获得无选择标记的转基因植株。

双价反义载体构建及对大白菜的遗传转化

为获得抗芜菁花叶病毒病、耐抽薹的大白菜植株,进行了双价反义植物表达载体的构建和遗传转化研究。在利用TuMV-Nib、LFY基因,构建成反义双价植物表达载体,转化农杆菌LBA4404,获得工程菌株的基础上,采用农杆菌介导的真空渗入法转化大白菜4个高代自交系材料,获得了经PCR检测和TuMV感染鉴定的16株转基因植株。经田间鉴定有7株表现为抗病毒和耐抽薹。该结果可为抗病毒病、耐抽薹的转基因大白菜提供种质材料。