转基因鱼腥藻7120光异养生长的研究

研究了不同有机碳源对转基因鱼腥藻 712 0生长的影响 ,在此基础上进行了光异养条件的优化 ,并研究了外源添加剂L -精氨酸、生长激素 2 ,4 -D与KT对藻细胞生长的影响 .结果表明 :蔗糖和葡萄糖能促进藻体的生长 ;最优碳氮源组合为葡萄糖 6 g/L、NaNO31.5g/L ,经高压灭菌 ;L -精氨酸不支持藻体的光异养生长 ;一定含量的 2 ,4 -D与KT能促进藻体在光异养条件下的后期生长 .

转基因鱼腥藻7120适宜生长条件的初步研究

以前的研究报导了将人肿瘤坏死因子基因(TNF-α)成功转入鱼腥藻7120中,这项研究在实验室小规模范围内探讨了其转TNF-α基因鱼腥藻7120的适宜生长条件。结果表明,转基因鱼腥藻7120最适生长温度在25～30℃,最适pH7.0～7.5。不同光照强度下的净光合放氧速率测定结果表明,转基因鱼腥藻7120与野生型具有一致的光饱和点和光补偿点,且适合在10～700μE.m-2.s-1下生长。外加有机碳源(4g/L葡萄糖)一定程度上可以增加转基因鱼腥藻7120生长速度。对不同藻龄转基因鱼腥藻7120中TNF-α的累积量的检测发现:生长8d左右时转基因鱼腥藻7120中TNF-α累积量达到最大值。这将为产业化生产、适时收获转基因蓝藻提供理论指导,同时讨论了葡萄糖对转基因鱼腥藻7120代谢的调节。

环境因子对转基因鱼腥藻7120生长的影响

研究了培养瓶规格、光照时间、光质以及温度对转基因鱼腥藻７１２０生长的影响，结果表明：在 ５ ％接种量下，培养瓶规格越小，越有利于藻体的生长；藻体的生长以每天 １８ ｈ的光暗交替的光照时间最好；单色光对藻体的生长以蓝光效果最好；藻体生长的最佳温度为２５～３０℃．

植物生长调节剂对转基因鱼腥藻7120生长与外源基因表达的影响

适宜浓度的IBA、6-BA、赤霉酸和氯化胆碱均促进转基因鱼腥藻7120生长,提高其生物量,不影响外源基因表达,但从总体上讲高浓度植物生长调节剂则抑制藻细胞生长,降低外源基因表达水平。这些植物生长调节剂混合施用促进转基因鱼腥藻生长效果不如单一因子好,外源基因表达水平也略有下降。

转基因鱼腥藻7120流加培养的研究

流加培养对转TNF—α基因鱼腥藻7120的生长有利.单独流加碳源对转基因鱼腥藻7120生长与外源基因表达影响很小,单独流加氮源和同时流加碳氮源可明显促进生长,生物量达到2.964g/L和3.059g/L,分别增长9.91％和12.71％,而且能轻微促进藻细胞中的TNF表达.

hGM-CSF基因穿梭表达载体的构建及其在鱼腥藻7120中的克隆

人粒—巨噬细胞集落刺激因子(hGM-CSF)作为一种造血生长因子,能够刺激T细胞和巨噬细胞增殖、成熟和分化,具有极其重要的免疫调解功能。本研究运用PCR方法,从质粒pAG-MT-8中克隆该基因,并在其5′端添加有利于在蓝藻细胞中高效表达的SD序列,然后插入到表达载体(pRL-439)强启动子PpsbA的下游,进一步与穿梭表达载体pDC-08相连构建成穿梭表达载体pDC-GM。利用三亲接合转移方法将该穿梭表达载体(pDC-GM)转入丝状鱼腥藻7120,通过相应抗生素筛选后得到能稳定遗传的转基因藻。以该转基因藻的基因组DNA为模板进行PCR检测,结果表明hGM-CSF基因已转入鱼腥藻7120。这是首次尝试把蓝藻作为制备重组hGM-CSF的新宿主,具有潜在的经济价值和社会效益。

镧对转基因鱼腥藻生长和外源基因表达的影响

摇瓶中研究镧对转基因鱼腥藻生长和外源基因表达的影响。结果发现硫酸镧浓度低于500μg/L,对生长基本无影响,但随着浓度的增大,对生长的抑制作用逐渐明显。镧对转基因鱼腥藻7120蛋白含量和TNF表达水平的影响相似,低于200μg/L几乎没有影响,随着浓度升高,蛋白含量和TNF表达水平均降低。实验结果表明在转基因鱼腥藻培养过程中应避免高浓度的稀土元素存在。

高温和红光诱导的鱼腥藻7120短藻丝体中TNF-α基因表达效率的提高

目前解决外源基因在蓝藻中低效表达的主要策略是改进供体DNA元件。这项工作尝试改变受体系统生理状态,研究对外源基因表达效率的影响。以前已经报道用高温(45℃)和红光处理鱼腥藻7120(Anabaenasp.PCC7120)可以诱导其形成短藻丝体,这里报道以此作为受体细胞,将构建的含重组人肿瘤坏死因子α(TNF-α)基因的穿梭表达载体pKT-TNF通过三亲接合转移法进行转化。红光和高温诱导形成的短藻丝体中,TNF-α基因接合转移效率为在正常营养藻丝中的5～6倍,Southern杂交结果证明pKT-TNF已在受体细胞中复制。Western印迹表明TNF-α基因已在受体系统中表达,放射免疫测定结果显示在短藻丝体中的表达效率提高到在正常营养藻丝中的4～5倍。这可能为提高外源基因在丝状蓝藻中的表达效率提供了一条新途径。此外,研究还分析了人TNF-α基因密码子使用偏向性对在鱼腥藻7120中表达效率的影响。

环境因子对转基因鱼腥藻培养的影响

摇瓶中对转TNF -α基因鱼腥藻 712 0 (Anabaenasp .PCC712 0 ,pDC -TNF)混合培养条件进行了研究 ,在含蔗糖 9g/L ,NaNO3 2 .2 5g/L的BG - 11培养基混合培养时 ,得到最适培养条件接种量 5 %,光照强度为 10 0 0Lux ,光 /暗周期 (光照时间 /黑暗时间 ) 12h/ 12h ,温度 2 5～ 30℃ ,自然初始 pH值 ,10 0mL摇瓶装液量 4 0mL ,转基因鱼腥藻 15d生物量可达到 3g/L以上 ,可溶性蛋白含量接近 30 %,TNF表达水平大于 2 2 %,与自养相比 ,生物量增加 82 .0 6 %,表达水平提高38.79%。证明混合营养型培养是转rhTNF -α基因鱼腥藻 712 0实现高密度、高表达培养的途径。

鱼腥藻PCC7120基因all5292和alr0647的初步研究

通过BLAST软件分别对藻胆蛋白裂合酶(biliprotein lyase)编码基因cpcS和cpcT进行同源搜索分析,在鱼腥藻(Anabaena)PCC7120中获取了同源基因all5292和alr0647。同源分析发现,这两个基因所编码氨基酸序列与其相对应的裂合酶氨基酸序列相似程度分别达到53.4%和61.4%。随后,对这两个基因进行了初步研究。结果显示:All5292和Alr0647无论单独还是共同表达均没有裂合酶催化藻蓝胆素PCB结合到藻蓝蛋白(phycocyanin)或藻红蓝蛋白(phycoerythrocyanin)β亚基上的功能。通过在不同生理条件下对鱼腥藻PCC7120的培养,还对这两个基因的调控表达进行了初步的探索。结果表明:all5292和alr0647的表达与氮源的缺乏与否有联系,在氮胁迫条件下两个基因均进行了转录而在氮源充足的情况下则没有表达。

启动子Pcpcβ提高鱼腥藻7120中hGM-CSF基因表达效率的研究

利用聚球藻7002中编码藻蓝蛋白基因(cpcβ)的启动子(Pcpcβ),替代穿梭表达载体pDC-GM中的启动子PpsbA,启动外源人粒巨噬细胞集落刺激因子(hGM-CSF)基因在鱼腥藻7120中的表达。蛋白免疫印迹证实,在含Pcpcβ启动子的cGM藻株中,hGM-CSF基因的表达水平比原先构建的含PpsbA启动子的GM藻株中提高了90%,且该基因的高效表达对宿主细胞的生长未产生明显影响。结果表明,对于在蓝藻中表达hGM-CSF基因而言,Pcpcβ启动子可能是较适宜的强启动子之一。

生物反应器培养转基因鱼腥藻的研究

在反应器中研究了转人TNF α基因鱼腥藻 712 0 (Anabaenasp .PCC712 0 ,pDC TNF)的培养。结果表明气升式反应器适合于转基因鱼腥藻的培养。气升式反应器中通气量和光照是主要的影响因素 ,观察到 1L罐中最适通气量为 6 0～ 75L/h ,最适光照强度为 12 0 0lx ,此时在 2 5℃混养 ,光照时间 /黑暗时间为 12h/ 12h ,15d生物量干重大于 3g/L ,TNF表达水平约占总可溶蛋白的2 2 % ,达到了摇瓶培养水平。实验发现添加维生素B130 0 μg/L、B12 2 0 0 μg/L和生物素 4 μg/L时 ,生产周期为 12d ,缩短 2 0 % ,表达水平相同。培养过程通入含有 5 %CO2 的空气 ,能促进生长 ,缩短生产周期 ,但收获生物量不受影响。从添加维生素和通入CO2 的培养结果证明反应器中培养时 ,光照是限制性因素 ,当反应器系统一定时 ,最终生物量有一个最大值 ,如需进一步提高产量 ,必须设法改变光照系统。

pH值对转基因鱼腥藻培养的影响

研究pH值对转基因鱼腥藻培养的影响,发现培养基初始pH以自然pH8 3为宜。间歇流加稀盐酸控制过程pH值为8 5和9 0,生长较未流加快,每天流加稀盐酸一次控制过程pH为8 5,15d生物量大于3g/L,可溶性蛋白为0 3g/l藻干重,TNF表达量超过22%,生物量比未流加增长12 41%,而TNF表达量未受影响。

鱼腥藻PCC 7120染色体上relBE同源基因的克隆及表达

为研究鱼腥藻PCC7120染色体上与relBE同源的基因asl4561和asl4562表达产物的毒素-抗毒素作用,从鱼腥藻细胞中提取总基因组DNA,设计特异引物PCR扩增目的基因asl4561和asl4562,与T载体连接后经XhoI和EcoR I双酶切并与表达载体pET28a(+)连接,由IPTG诱导表达,并在IPTG浓度和诱导时间上对asl4561基因的表达条件进行了优化.琼脂糖凝胶电泳显示扩增出了264bp的asl4561基因和213bp的asl4562基因,SDS-PAGE检测表明成功表达出15.65kD和13.55kD的两蛋白,当诱导温度28℃、IPTG浓度0.4 mmol/L、诱导时间6h时,asl4561基因表达蛋白在细菌裂解液上清中表达量最大.

鱼腥藻PCC7120质粒上毒素-抗毒素基因对alr9029/asr9028的初步研究

指出了大肠杆菌的毒素-抗毒素系统(TAs)能介导解离后致死机制维持细菌质粒的稳定性和参与环境胁迫诱导细菌生长抑制或死亡,在鱼腥藻PCC7120质粒上的基因对alr9029/asr9028具有与TA系统较高的同源性.为了证实该基因对属于TA系统,通过生物信息学分析了alr9029/asr9028的遗传结构,设计特异性引物,扩增得到大小为198 bp的asr9028和387 bp的alr9029.PCR产物经Bam H I和HindШ双酶切后被插入p MD18-T和p ET-30a中,依次构建克隆载体和表达载体.经SDS-PAGE电泳检测,含有His6标签的表达蛋白相对分子量分别为12.4k Da和19.2 k Da,且为可溶性蛋白.故初步认定asr9028为抗毒素基因,alr9029为毒素基因,二者共同构成一个TA系统.

转TNF-α基因鱼腥藻7120质粒稳定性研究

为了实现转基因鱼腥藻培养生产TNF的目的 ,研究了转基因鱼腥藻的稳定性。影印法证实转TNF -α基因鱼腥藻 712 0能保持质粒分配稳定性。比较无选择压力下连续传代的转基因鱼腥藻 712 0在不同培养基中的生长和外源基因表达 ,证实没有发生质粒部分缺失 ,但转基因鱼腥藻在无选择压力下会降低重组质粒拷贝数。在培养过程中 ,种子培养基含有的新霉素可以保持生产过程质粒稳定 ,这可以大大减少新霉素用量。

转hTNF-α基因鱼腥藻7120的培养及外源基因的表达调控

讨论了转hTNF -α基因鱼腥藻 712 0外源基因的调控和重组质粒的稳定性问题 。

转基因鱼腥藻培养中培养液吸光度与生物量的关系

对转基因鱼腥藻Anabaenasp .PCC712 0 ,培养液的吸光特性进行了研究 ,在可见光范围内 ,有 5个吸收峰 ,波长分别为 345nm、4 10nm、4 4 0nm、6 35nm、6 85nm ,其中 4 4 0nm是最大吸收波长。一定稀释度范围内 ,在各波长下 ,培养液中藻干重与吸光度均成正比 ,但不同培养基其干重 -吸光度标准曲线不同 ,实验得到不同培养基的标准曲线 。

鱼腥藻PCC7120染色体MazEF同源基因对asr0757/alr0758的初步研究

鱼腥藻PCC7120染色体上的基因对asr0757/alr0758,经NCBI比对显示其与大肠杆菌中的毒素-抗毒素基因Maz EF具有较高的同源性,且具有毒素-抗毒素系统基因的保守遗传结构,为研究其是否属于Maz EF家族系统基因,构建同时含有asr0757和alr0758基因的双启动子选择性表达载体,先选择性诱导了该基因对的表达,再验证了其表达产物对细菌生长的影响.结果显示:成功诱导表达出了目的蛋白asr0757(13.5KD)和alr0758(17.5KD),当单独诱导asr0757基因表达时,细菌生长状况不受影响,单独诱导alr0758表达时细菌生长明显受到抑制,同时诱导asr0757和alr0758基因时细菌生长恢复正常,说明asr0757/alr0758构成具有生物功能的Maz EF家族系统基因对,具有毒性与抗毒性功能.