镧对转基因鱼腥藻生长和外源基因表达的影响

摇瓶中研究镧对转基因鱼腥藻生长和外源基因表达的影响。结果发现硫酸镧浓度低于500μg/L,对生长基本无影响,但随着浓度的增大,对生长的抑制作用逐渐明显。镧对转基因鱼腥藻7120蛋白含量和TNF表达水平的影响相似,低于200μg/L几乎没有影响,随着浓度升高,蛋白含量和TNF表达水平均降低。实验结果表明在转基因鱼腥藻培养过程中应避免高浓度的稀土元素存在。

环境因子对转基因鱼腥藻培养的影响

摇瓶中对转TNF -α基因鱼腥藻 712 0 (Anabaenasp .PCC712 0 ,pDC -TNF)混合培养条件进行了研究 ,在含蔗糖 9g/L ,NaNO3 2 .2 5g/L的BG - 11培养基混合培养时 ,得到最适培养条件接种量 5 %,光照强度为 10 0 0Lux ,光 /暗周期 (光照时间 /黑暗时间 ) 12h/ 12h ,温度 2 5～ 30℃ ,自然初始 pH值 ,10 0mL摇瓶装液量 4 0mL ,转基因鱼腥藻 15d生物量可达到 3g/L以上 ,可溶性蛋白含量接近 30 %,TNF表达水平大于 2 2 %,与自养相比 ,生物量增加 82 .0 6 %,表达水平提高38.79%。证明混合营养型培养是转rhTNF -α基因鱼腥藻 712 0实现高密度、高表达培养的途径。

植物生长调节剂对转基因鱼腥藻7120生长与外源基因表达的影响

适宜浓度的IBA、6-BA、赤霉酸和氯化胆碱均促进转基因鱼腥藻7120生长,提高其生物量,不影响外源基因表达,但从总体上讲高浓度植物生长调节剂则抑制藻细胞生长,降低外源基因表达水平。这些植物生长调节剂混合施用促进转基因鱼腥藻生长效果不如单一因子好,外源基因表达水平也略有下降。

生物反应器培养转基因鱼腥藻的研究

在反应器中研究了转人TNF α基因鱼腥藻 712 0 (Anabaenasp .PCC712 0 ,pDC TNF)的培养。结果表明气升式反应器适合于转基因鱼腥藻的培养。气升式反应器中通气量和光照是主要的影响因素 ,观察到 1L罐中最适通气量为 6 0～ 75L/h ,最适光照强度为 12 0 0lx ,此时在 2 5℃混养 ,光照时间 /黑暗时间为 12h/ 12h ,15d生物量干重大于 3g/L ,TNF表达水平约占总可溶蛋白的2 2 % ,达到了摇瓶培养水平。实验发现添加维生素B130 0 μg/L、B12 2 0 0 μg/L和生物素 4 μg/L时 ,生产周期为 12d ,缩短 2 0 % ,表达水平相同。培养过程通入含有 5 %CO2 的空气 ,能促进生长 ,缩短生产周期 ,但收获生物量不受影响。从添加维生素和通入CO2 的培养结果证明反应器中培养时 ,光照是限制性因素 ,当反应器系统一定时 ,最终生物量有一个最大值 ,如需进一步提高产量 ,必须设法改变光照系统。

环境因子对转基因鱼腥藻7120生长的影响

研究了培养瓶规格、光照时间、光质以及温度对转基因鱼腥藻７１２０生长的影响，结果表明：在 ５ ％接种量下，培养瓶规格越小，越有利于藻体的生长；藻体的生长以每天 １８ ｈ的光暗交替的光照时间最好；单色光对藻体的生长以蓝光效果最好；藻体生长的最佳温度为２５～３０℃．

pH值对转基因鱼腥藻培养的影响

研究pH值对转基因鱼腥藻培养的影响,发现培养基初始pH以自然pH8 3为宜。间歇流加稀盐酸控制过程pH值为8 5和9 0,生长较未流加快,每天流加稀盐酸一次控制过程pH为8 5,15d生物量大于3g/L,可溶性蛋白为0 3g/l藻干重,TNF表达量超过22%,生物量比未流加增长12 41%,而TNF表达量未受影响。

转基因鱼腥藻培养中培养液吸光度与生物量的关系

对转基因鱼腥藻Anabaenasp .PCC712 0 ,培养液的吸光特性进行了研究 ,在可见光范围内 ,有 5个吸收峰 ,波长分别为 345nm、4 10nm、4 4 0nm、6 35nm、6 85nm ,其中 4 4 0nm是最大吸收波长。一定稀释度范围内 ,在各波长下 ,培养液中藻干重与吸光度均成正比 ,但不同培养基其干重 -吸光度标准曲线不同 ,实验得到不同培养基的标准曲线 。

CO_2对转基因鱼腥藻生长的影响

为了进一步探索转基因鱼腥藻高密度培养的方法 ,在小型气升式反应器中研究了CO2 对转基因鱼腥藻 712 0培养的影响。结果发现转基因鱼腥藻培养过程中通入 5 %CO2 能促进藻细胞生长 ,12d生物量提高 7.4 4 % ,由于光照限制 ,不能大幅提高15d收获生物量 ,但生长周期能缩短近 2 0 % ;而高浓度 (10 % )的CO2 抑制转基因鱼腥藻的生长。CO2 是通过调节pH值和影响碳源利用来影响藻细胞生长的 ,合适浓度的CO2 有利于转基因鱼腥藻的培养。

转基因鱼腥藻7120光异养生长的研究

研究了不同有机碳源对转基因鱼腥藻 712 0生长的影响 ,在此基础上进行了光异养条件的优化 ,并研究了外源添加剂L -精氨酸、生长激素 2 ,4 -D与KT对藻细胞生长的影响 .结果表明 :蔗糖和葡萄糖能促进藻体的生长 ;最优碳氮源组合为葡萄糖 6 g/L、NaNO31.5g/L ,经高压灭菌 ;L -精氨酸不支持藻体的光异养生长 ;一定含量的 2 ,4 -D与KT能促进藻体在光异养条件下的后期生长 .

转基因鱼腥藻7120流加培养的研究

流加培养对转TNF—α基因鱼腥藻7120的生长有利.单独流加碳源对转基因鱼腥藻7120生长与外源基因表达影响很小,单独流加氮源和同时流加碳氮源可明显促进生长,生物量达到2.964g/L和3.059g/L,分别增长9.91％和12.71％,而且能轻微促进藻细胞中的TNF表达.

转基因满江红鱼腥藻细胞内颗粒体的变化

用透射电镜观察 NPTⅡ(新霉素磷酸转移酶ⅡNeomycin phosphotransferaseⅡ)在满江红鱼腥藻染色体glnA(谷氨酰氨合成酶基因)位点定点整合后藻细胞内颗粒体的变化.转基因后的满江红鱼腥藻细胞内的代谢发生了很大的变化,为了快速适应和自我调节这一变化,细胞内的储藏颗粒处在积聚与解积聚的动态转化过程中.通过了解储藏颗粒的结构变化,可为研究转基因藻细胞光合固氮及生理生化的变化提供物质结构方面的信息.

NPTⅡ在glnA位点的定点整合对转基因满江红鱼腥藻细胞形态和超微结构的影响

本文用透射电镜结合扫描电镜观察了转基因满江红鱼腥藻细胞形态和超微结构的变化。与对照细胞相比较，转基因满江红鱼腥藻细胞外被有粘性分泌物堆集，不如对照光滑。转化藻丝较对照藻丝短。此外，异细胞分布频率也有较大变化，５＃转基因藻比对照高出２５％。透射电镜观察发现转基因藻细胞外壁结构，内膜系统和内含物等成份均发生了显著变化。尤其发现大量颗粒，或围绕质膜成规则排列，或呈非规则聚积散布细胞内。这些对形态和超微结构观察的结果较好地说明了转基因藻细胞光合固氮生理生化活性的变化。

转基因鱼腥藻中hTNF-α基因表达与光合作用间的相关性研究

分析了培养光强对转基因鱼腥藻生长和hTNF-α基因表达的影响,以及转基因鱼腥藻IB02的光合放氧活性、光系统Ⅰ及光系统Ⅱ活性。发现光强对转基因鱼腥藻IB02的生长和hTNF-α基因表达都有促进;hTNF-α基因在鱼腥藻中的表达率与真正光合、光系统Ⅰ和光系统Ⅱ活性存在一定的联系。hTNF-α基因表达同时对宿主的光合放氧特性也产生了显著的影响,与正对照相比转基因藻光呼吸速率增强68%,饱和点降低66%,说明转基因鱼腥藻的代谢负荷增加,并在低光强下生长比野生型快。

转人粒细胞集落刺激因子(hG-CSF)基因的鱼腥藻的构建

本研究目的是构建转G-CSF基因的工程鱼腥藻Anabaenasp.。首先将b型G-CSF克隆于中间载体pRL439和穿梭表达载体pDC-8上。通过三亲接合转移将穿梭表达载体pDCG-CSF转入鱼腥藻内。通过PCR扩增的方法在转基因鱼腥藻中检测到G-CSF基因的存在。

温度对铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)和鱼腥藻(Anabaena sp.)生长及胞外有机物产生的影响

以巢湖优势种铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)和鱼腥藻(Anabaena sp.)为研究对象,研究不同温度(35、25和10℃)对这两种藻生长特性和胞外有机物产生的影响.结果表明,温度对铜绿微囊藻和鱼腥藻的藻细胞密度、碱性磷酸酶活性和胞外有机物浓度影响显著.25℃是铜绿微囊藻和鱼腥藻最适宜的生长温度,最高细胞密度分别达到3.12×107cells/ml和2.03×107cells/ml.不同温度下两种藻的碱性磷酸酶活性特征,证实了高温对鱼腥藻生长的抑制和低温对铜绿微囊藻生长的抑制.胞外有机物释放总量受蓝藻生物量和单位细胞有机物释放速率的影响.铜绿微囊藻的溶解性有机碳和胞外总多糖释放量在25℃最高,最大值分别为49.28和38.46 mg/L;而鱼腥藻在35℃时释放量最高,最大值分别为45.82和40.60 mg/L;10℃条件抑制了两种藻的生长及胞外有机物的释放.鱼腥藻胞外多糖含量在35℃培养条件下最高,而铜绿微囊藻在10℃条件下最高,说明不利的生长条件会促进蓝藻胞外多糖的分泌.三维荧光图谱分析结果表明,铜绿微囊藻和鱼腥藻胞外有机物以类蛋白质和类腐殖酸为主,温度主要影响藻细胞胞外有机物浓度,而对有机物种类组成没有影响.

重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)基因在鱼腥藻中的克隆

为了将rhG-CSF基因在鱼腥藻PCC7120中克隆,用于制备口服制剂,利用DNA重组技术,在不改变阅读框的前提下,将hG-CSF基因进行突变,并插入到pUC-19载体上,构建中间载体pUC-G-CSF;将pUC-G-CSF插入到pRL-489的启动子PpsbA的下游,构建穿梭表达载体pRL-G-CSF;通过三亲接合转移方法,将pRL-G-CSF转入丝状体蓝藻鱼腥藻PCC7120内。本试验得到了有抗生素抗性的鱼腥藻,并用PCR技术检测到rhG-CSF基因在转基因鱼腥藻中存在。

环境因子对转hGM-CSF基因鱼腥藻生长与光合的调节

以转hGM-CSF基因鱼腥藻7120为对象,分别探讨了温度、pH、光强等环境因子和外加碳、氮等基本营养源对转基因藻生长与光合活性的影响.结果表明:当基本环境因子为30℃、pH9.5和90μmol·m-2·s-1光强时,转基因藻生长最快.添加10mmol·L-1的NaHCO3或5g·L-1的葡萄糖对转基因藻的光合活性促进最大;但外加氮源却抑制了转基因藻的光合活性.

TNF_α基因在鱼腥藻 71 2 0中的表达及其产物的亲和层析纯化

用转入TNF_α基因并稳定表达了 4年多的丝状体蓝藻———鱼腥藻 712 0 (Anabaenasp .PCC 712 0 ) ,研究比较了在培养液中氮源 (NaNO3 )和碳源 (NaAc)对转基因藻生长和TNF_α基因的不同影响。氮源能稳定外源蛋白的表达 ,而碳源则影响细胞壁的合成。通过比较几种不同的破碎细胞的方法 ,发现超声破碎得到的可溶性总蛋白含量和TNF_α含量均要比冻融法高出 1倍左右 ,经过细胞破碎、硫酸铵分级沉淀、常压离子交换液相层析后 ,除去杂蛋白及大量容易堵柱的糖类等物质 ,最后通过亲和柱层析 ,分离出了纯的目标蛋白———重组肿瘤坏死因子 (TNF_α)。经凝胶电泳鉴定为单一的谱带 ,分子量为

转TNF-α基因鱼腥藻7120质粒稳定性研究

为了实现转基因鱼腥藻培养生产TNF的目的 ,研究了转基因鱼腥藻的稳定性。影印法证实转TNF -α基因鱼腥藻 712 0能保持质粒分配稳定性。比较无选择压力下连续传代的转基因鱼腥藻 712 0在不同培养基中的生长和外源基因表达 ,证实没有发生质粒部分缺失 ,但转基因鱼腥藻在无选择压力下会降低重组质粒拷贝数。在培养过程中 ,种子培养基含有的新霉素可以保持生产过程质粒稳定 ,这可以大大减少新霉素用量。