转导单链免疫毒素基因的PBMCs对人肝癌细胞SMMC-7721的体外杀伤活性

目的:用携带分泌型抗肝癌单链免疫毒素基因(sFv-TNF-α)的重组逆转录病毒感染人外周血单个核细胞(peripheralbloodmononuclearcells,PBMCs),使其表达并分泌针对人肝癌细胞的sFv-TNF-α融合蛋白,观察转导的PBMCs对体外培养人肝癌细胞SMMC-7721的杀伤作用.方法:用感染性重组病毒产生细胞C22(PA317/PST)产生的病毒上清转导人PBMCs,采用PCR和RT-PCR方法对转导的PBMCs(PBMCs/PST)进行DNA和mRNA水平的分析.PBMCs/PST与SMMC-7721共培养,MTT法检测PBMCs/PST表达产物对肝癌细胞的体外杀伤活性.结果:PCR及RT-PCR结果显示PBMCs/PST中扩增出外源目的基因对应的电泳条带.MTT法检测结果,分泌型抗肝癌单链免疫毒素对体外培养肝癌细胞SMMC-7721的杀伤率为(38.2±6.7)%.结论:分泌型抗肝癌单链免疫毒素基因可以在PBMCs中整合并稳定表达,其分泌的表达产物对SMMC-7721具有一定的体外杀伤作用.

抗肝癌单链免疫毒素基因修饰的PBMCs在动物体内的抑瘤作用

目的:用携带分泌型抗肝癌单链免疫毒素基因(sFv-TNF-α)的重组逆转录病毒感染人外周血单个核细胞(peripheralblood mononuclear cells,PBMCs),使其表达并分泌针对人肝癌细胞的sFv-TNF-α融合蛋白,观察转导的PBMCs/PST静脉注射后对荷肝癌裸鼠的抑瘤作用.方法:分离正常人PBMCs并用PHA和IL-2进行体外刺激培养,用感染性重组病毒产生细胞C22(PA317/PST)产生的病毒上清转导后,经尾静脉输入荷肝癌裸鼠体内,注射细胞数为每只1×106(0.2 mL),每5 d注射1次,共注射3次.定期观察记录肿瘤生长情况,注射3次后处死,取出瘤组织称质量、记录,进行统计学处理,并制备石蜡切片进行常规HE染色及免疫组化染色观察.结果:实验组肿瘤生长速率为(20.8±4.9)mg/d,对照组为(28.5±6.7)mg/d,经t检验,P＜0.05.结论:经重组逆转录病毒转导的PBMCs/PST在课鼠体内对人肝癌细胞系SMMC-7721移植瘤具有一定的生长抑制作用.

抗癌胚抗原单链抗体-PE40免疫毒素基因的克隆与表达

目的扩增抗癌胚抗原单链抗体(CEA-ScFv),与绿脓杆菌外毒素(PE40)进行重组及原核表达,旨在进一步研究重组蛋白CEA-ScFv-PFA0的靶向抗肿瘤作用。方法分别扩增抗癌胚抗原单链抗体的重链区、轻链区,用overlap PCR按照VH-VL的顺序连接,克隆至pMD18T载体中。再将VH-VL基因片段与含有.PE40的表达载体pET28a连接,转化B121(DE3),IPTG诱导表达。结果经DNA测序,其结果与设计完全相符。SDS-PAGE分析,在相对分子质量66000处可见明显表达带,表达量可占菌体蛋白总量的13％以上。免疫印迹表明重组蛋白具有PF40的抗原特异性。结论抗癌胚抗原单链抗体-PE40免疫毒素的成功克隆与表达,为进一步研究其生物活性奠定基础。

抗胃癌单链抗体免疫毒素的制备及活性检测

目的 对抗胃癌单链抗体免疫毒素基因重组质粒进行表达 ,进而获得有活性的单链抗体免疫毒素。方法 应用IPTG诱导大肠杆菌表达系统进行单链抗体免疫毒素基因重组质粒的表达 ,并对产生的不溶性包涵体进行纯化 ,经变性、复性后 ,观察其生物学活性。结果 诱导表达了约 6 6KD的蛋白 ,分子量符合预计大小 ,以包涵体的形式存在于菌体中。经包涵体纯化、变性、复性 ,使其折叠为正确的空间结构 ,经检测可与胃癌细胞MGC80 3特异结合 ,并有一定的细胞毒性。结论 获得了可与胃癌细胞系MGC80 3特异结合 。

抗肿瘤基因工程单链抗体及其免疫霉素的研究

抗体V_H基因和V_L基因经寡核苷酸接头连接成ScFv基因,转入原核或真核表达系统中表达ScFv.ScFv具有亲本抗体相同的抗原结合特性和能力,且抗原性大大减弱.ScFv分子量小,易穿入肿瘤和实体组织内部, 也易进入病毒峡谷.ScFv与药物、毒素、同位素或酶等偶联构成的导向治疗制剂在血中清除迅速,不残留于正常组织,尤其不在肾脏中积聚,因而毒副作用很小.PCR技术的应用,使制备单链兔疫毒素在二周内即可实现,大大缩短了导向药物的制备时间.改善培养条件,E.coli能表达并装配和折叠成具有生物活性的双价ScFv及其免疫毒素.

人源化抗肝癌单链抗体与牛蛙核糖核酸酶融合基因的构建及表达

利用RT-PCR的方法从牛蛙肝脏中克隆牛蛙核糖核酸酶(RC-RNase)基因并进行序列测定;将人源化抗肝癌单链抗体scFv基因与RC-RNase基因相连接,制备scFv-RC-RNase融合基因表达质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导进行表达。以SDS-PAGE和免疫印迹法对表达产物进行分析鉴定。序列分析表明,扩增出的RC-RNase基因片断大小约为405bp。经SDS-PAGE和免疫印迹分析显示,scFv-RC-RNase融合基因表达质粒在大肠杆菌中的诱导表达产物出现相对分子质量约为38000的一条新生蛋白带,与预期结果相符。融合蛋白表达量占菌体总蛋白量的18.5%,主要以包涵体形式存在。表明成功地构建了抗肝癌scFv-RC-RNase融合基因,并在大肠杆菌中获得有效表达,为进一步进行肝癌的导向治疗研究奠定了基础。

基因工程单链抗体的研究进展及临床应用

基因工程抗体在医学生物学研究、疾病的诊断治疗及其他方面有着广泛应用。近年来国内外学者对基因工程抗体进行了广泛的研究,涉及到抗体基因的获取、构建、表达及最后的应用。尤其是单链抗体(single chain antibody,SCA & single chain Fv,ScFv),因其具有抗原亲活性、分子量小、穿透力强、体内循环半衰期短及排除了Fc段所致的免疫复合物反应等优点,而成为基因工程抗体研究领域中的热点课题。特别是将抗体进行人源化改造、与免疫毒素连接形成融合蛋白的研究已取得突破性进展,目前已有多个人源性ScFv抗体获美国FDA的批准。笔者认为,如果能进一步提高其稳定性及表达产量,开拓免疫毒素及其它新型免疫融合蛋白的研究范围,制备出性能稳定、特异性强、亲和力高、效能多样的基因工程抗体,就可在更大范围取得更大的成绩。

抗CD5单链抗体融合毒素的研究

免疫毒素是目前导向药物研究的一个活跃领域，以抗ＣＤ５抗体为导向的免疫毒素可应用于自身免疫性疾病、淋巴性细胞瘤、淋巴性细胞白血病的治疗及器官移植和骨髓异体移植的辅助治疗中。作者将抗ＣＤ５单链抗体基因与绿脓杆菌外毒素ＰＥ４０和ＰＥ３５基因融合，表达出抗ＣＤ５单链体融合毒素。作者从分泌抗ＣＤ５单克隆抗体的杂交瘤细胞中提取ｍＲＮＡ，ＲＴ－ＰＣＲ扩增出抗体ＶＨ和ＶＬｃＤＮＡ双链，组装成单链抗体基因，插入到噬菌粒ｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ上，进行噬菌体表面呈现。用表达细胞表面抗原ＣＤ５分子的Ｍｏｌｔ－４细胞，对呈现单链抗体的重组噬菌体进行二轮富集、筛选，克隆阳性率超过１０％。通过细胞一ＥＬＩＳＡ法鉴定，选出４株高亲和力的克隆。ＤＮＡ序列分析表明单链抗体全长７３２个碱基，其中ＶＨ为３３９碱基，ＶＬ为３００ｂｐ，属于鼠的抗体家族。单链抗体基因在Ｅ．ｃｏｌｉＨＢ２１５１中进行可溶性表达，表达产物主要分布于周质之中，占周质蛋白的２０％～２５％。绿脓杆菌外毒素（ＰＥ）截去细胞结合活性结构域即为ＰＥ４０，它保留了跨膜转运功能和ＡＤＰ糖基化酶活性。进一步缺失３６５～３８０残基的重组毒素为ＰＥ３５。将单链抗体基因分别与ＰＥ４０与ＰＥ３５ＤＮＡ?

抗肝癌单链抗体与PE38融合蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达

目的 :实现二硫键稳定的抗肝癌单链抗体与PE38融合 ,免疫毒素在大肠杆菌中的可溶性表达 ,为下游的活性检测等工作打下基础 .方法 :设计了两种不同的表达载体(GST、硫氧还蛋白促可溶表达载体 ) ,并通过改变宿主菌菌株、IPTG诱导浓度、诱导温度及诱导时间等 ,优化表达条件 ;通过ELISA法判断该免疫毒素中单链抗体的结合活性 .结果 :抗肝癌单链抗体与PE38融合蛋白在大肠杆菌Origami(DE3)的上清中得到表达 ,表达量占菌体总可溶蛋白量的2 1% ;ELISA法证实该融合蛋白保持了亲本抗体的特异性 .结论 :dsFv

pGEX-e23(scFv) PE40融合基因的构建及其在大肠杆菌中的表达(英文)

目的 在大肠杆菌中表达抗原癌基因 c- erb B- 2表达产物 p185的单链抗体 e2 3(sc Fv) /假单孢菌属外毒素活性片段 PE40免疫毒素的融合蛋白 ,为乳腺癌、胃癌等多种 c- erb B-2呈过量表达的恶性肿瘤的免疫治疗奠定基础 .方法 去除克隆在真核表达载体 p L NCX中的 e2 3 (sc Fv) PE40基因 5′端编码信号肽的核苷酸序列 ,并将改建后的融合基因克隆到原核融合表达载体 p GEX- 4T中表达 .结果 序列测定表明 .改建后的抗 p185 e2 3(sc Fv) /PE40序列正确 .融合基因经IPTG诱导表达 4h后 ,经 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析 ,在Mr90 0 0 0处出现一条新生蛋白带 ,表达量约占菌体总蛋白的15 % .结论 成功改建并在原核中表达了抗 p185 e2 3(sc Fv) /PE40融合蛋白 .

双链AAV载体的构建及其转导效率的检测

基因治疗为人类多种疾病的治疗带来了希望．但其临床应用的道路曲折．问题在于安全和有效的基因输送系统的开发。如何将治疗基因特异、有效地传递给靶细胞，这是基因治疗中的关键。腺相关病毒（AAV）已被广泛用作基因治疗的载体。由于其安全性和低免疫反应性而受到人们的青睐，目前尚未见AAV与恶性疾病明确有关的报道。AAV为单链DNA病毒，由单链基因组向有转录活性的双链形式的转变限制了AAV载体介导的基因转导。自身互补双链DNA的腺相关病毒（scAAV）载体绕开了病毒DNA第二条链合成这一限速步骤，能显著提高AAV的转导效率。本研究率先在国内进行scAAV的构建和包装．并检测其转导效率。

抗CEA单链抗体与人hTNF-α融合基因的构建、表达和纯化

采用基因重组技术将已获得的抗癌胚抗原（ＣＥＡ） 单链抗体基因（ＳｃＦｖ） 与人肿瘤坏死因子α（ｈＴＮＦα） 基因拼接成抗ＣＥＡＳｃＦｖｈＴＮＦα（免疫毒素） 融合基因， 并克隆进大肠杆菌分泌性表达载体ｐＥＴ２２ｂ （ ＋ ） 中， 在大肠杆菌中表达了６ ×Ｈｉｓ免疫毒素融合蛋白， 其６ ×Ｈｉｓ 位于ＳｃＦｖ 的Ｎ 端， 在胞内以可溶性存在， 其表达量占菌体总蛋白的６％ ， ＳＤＳＰＡＧＥ 和Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ 显示表达产物分子量为４３ｋＤ， 与其基因编码蛋白的理论推算值相符。经Ｎｉ２＋ＩＤＡＳｅｐｈａｒｏｓｅ６Ｂ亲和柱一步纯化的６×Ｈｉｓ免疫毒素纯度可达９０％ 以上， 得率为０－２ｍｇ／１００ｍｌ。表达产物除了具有与ＣＥＡ 结合的活性， 也具有对Ｌ９２９细胞杀伤的功能。

肝、胆

双向电泳分析肝癌细胞线粒体的差异表达蛋白；利用体内噬菌体展示技术筛选肝癌组织特异性结合肽；抗肝癌单链免疫毒素HAb25（scFv）-PE40的构建及其导向作用的实验研究；HBx蛋白羧基端缺失对肝癌细胞生物学行为的影响；反义survivin-脂质体复合物对肝癌细胞生长凋亡和细胞周期的影响；抑癌基因PTEN对肝癌细胞增殖的抑制及作用机制.