沙雷氏Z4菌株Tn5转座突变株的群体淬灭活性筛选体系的建立及优化

利用Tn5转座子插入突变技术构建沙雷氏Z4菌株突变体库,研究不同因素对转座突变的影响,在此基础上初步探究了突变株的群体淬灭能力.结果表明,采用双亲本接合法,选择对数生长期的沙雷氏Z4菌株与大肠杆菌S17-1(pRL1063a)菌液1∶1混合,30℃培养3 h后,涂布于含50μg/mL卡那霉素和25μg/mL四环素的LB固体培养基上,长出的突变株数量最多;随机选择突变株进行群体淬灭能力测试,结果筛选到了3株群体淬灭能力明显与沙雷氏Z4野生型有差异的突变株.本研究采用的Tn5转座突变技术为研究群体淬灭菌的基因功能以及生理代谢提供了有效的分子遗传工具,也为研究群体淬灭提供了新的途径.

蒺藜苜蓿中1个聚半乳糖醛酸酶基因突变体的筛选及共生固氮表型的初步鉴定

以模式豆科植物蒺藜苜蓿中1个聚半乳糖醛酸酶(polygalacturonase,PG)基因为对象,对其进行生物信息学分析,结果显示:该基因全长4 150bp,其编码区1 278bp,编码425个氨基酸;其编码蛋白包括2个与细胞壁主要成分果胶降解有关的保守结构域PL-6superfamily和Glyco_hydro_28;该酶蛋白与鹰嘴豆、赤豆等豆科植物中的PG蛋白同源关系更近。苜蓿基因表达谱数据库分析和RT-PCR检测结果表明,MtPG在根瘤中呈显著增强表达,在非共生组织如根、叶中表达量很低。此外,基于该基因3个Tnt1转座子插入的目标候选突变体(NF0999、NF5561和NF4746)插入位点分析,得到1个纯合突变体材料NF4746,共生表型观察表明,MtPG基因在豆科植物共生固氮的早期侵染过程中发挥重要作用。

植物功能基因组研究中的基因敲除技术

综述了T-DNA插入突变和转座子插入突变等基因敲除技术的原理及其在植物功能基因组研究中的应用,并简要介绍了向国际有关机构索要或购买拟南芥插入突变体的方法。

睾丸酮丛毛单胞菌JL40中甲酸脱氢酶-O的锑抗性及锑氧化作用

利用转座子插入突变技术从睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)JL40中筛选出编码具有锑抗性及锑氧化作用的甲酸脱氢酶-O的fdhO基因。为了进一步验证fdhO基因的功能,在JL40中构建了fdhO基因突变株JL40-fdhO和互补株JL40-fdhO-C,并进行了锑抗性、生长及锑氧化实验。结果表明,fdhO基因突变株的锑抗性及锑氧化速率有所下降,互补株的锑抗性及锑氧化能力得到了一定的恢复。在大肠杆菌中异源表达fdhO基因时发现,与空载对照菌相比,表达fdhO基因的大肠杆菌提高了锑氧化速率。报告基因融合实验表明,fdhO基因的启动子受锑(Ⅲ)的诱导。综上表明,fdhO基因在睾丸酮丛毛单胞菌JL40中具有明显的锑氧化作用,但可能不是唯一的氧化酶;fdhO基因在细菌中的锑氧化功能将会为细菌锑抗性机制的进一步探究提供参考。

广藿香青枯病菌致病相关基因的筛选及分析

目的对广藿香青枯病菌致病相关基因进行筛选及分析。方法以广藿香青枯病菌菌株PRS-84的Tn5转座子插入突变株为材料,通过伤根浸泡法分别接种于广藿香植株,筛选致病性减弱的突变株;对筛选获得的突变株进行生长速率、泳动性和生物膜形成等表型分析;再利用反向PCR扩增致病性减弱突变株Tn5转座子插入位点的侧翼序列并进行序列测定与生物信息学分析。结果筛选得到了2个致病性减弱的突变株(PRS-84-11-33、PRS-84-11-123),它们对广藿香植株的致病性均明显低于野生株PRS-84。与野生株相比,致病性减弱突变株的菌落形态无明显变化,突变株PRS-84-11-123在培养后期生长速率有所升高。突变株PRS-84-11-33及PRS-84-11-123的泳动能力及生物膜形成能力均低于野生株。突变株Tn5转座子插入位点侧翼序列的生物信息学分析表明,这2个致病性减弱突变株的Tn5转座子插入位点基因分别为lptE基因和lon基因。结论该研究筛选获得了与广藿香青枯病菌致病性相关的基因,为了解青枯病菌的致病机制、寻找有效防治广藿香青枯病的方法提供了基础信息。

细菌Ensifer adhaerens M78产胞外多糖对矿物风化的影响

研究微生物与矿物的相互作用机制对阐明土壤形成以及生物地球化学循环的规律和机理具有重要作用.以高效矿物风化细菌粘着剑菌(Ensifer adhaerens)M78为供试菌株,该菌株2 d溶出钾长石结构元素Al、Si分别达35.04±1.02μmol/L、57.99±4.82μmol/L,多糖产量在第4天达最高值819±12 mg/L.采用转座子插入突变技术,筛选到胞外多糖产量及矿物风化能力显著下降的突变株MT3、MT6、MT10,并采用红外光谱及染色体步移技术分析野生株与突变株的多糖结构及突变株插入位点.结果显示,菌株M78的胞外多糖呈酸性,含有丰富的—COOH、—NH_(2)官能团,突变株MT3、MT6胞外多糖结构与野生株有显著差异,菌株MT10胞外多糖结构与野生株相似;突变株失活的基因分别为染色体复制起始响应调节蛋白基因ctrA、多酚氧化酶基因yfiH和荚膜多糖转运酶基因kpsE.本研究表明菌株M78产生的胞外多糖显著促进了矿物风化,基因kpsE、ctrA、yfiH可能通过影响胞外多糖的合成与转运影响菌株矿物风化能力.

天蓝色链霉菌中S-adenosylmethionine依赖性甲基转移酶同源基因sco1162调控孢子发育及抗生素合成

利用大肠杆菌-链霉菌穿梭质粒pDZY101携带的转座子Tn101随机插入到天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)M145构建的插入突变库,从中分离到一株孢子色素及抗生素合成明显发生变化的菌株BZ100.测序发现,该突变株中Tn101插入到了链霉菌的sco1162基因中.序列分析表明,该基因编码S腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine,SAM)依赖的甲基转移酶.为了验证该插入突变与表型的对应关系,构建了能在突变菌株中表达sco1162基因的互补质粒pFDZ16-1162,将该质粒转化突变株后,突变菌株的孢子形态和抗生素合成水平得到完全恢复.