双向转录/表达载体的构建及其在马流感病毒反向遗传系统中的应用

为构建用于拯救流感病毒的双向转录／表达载体，本研究以pEF4／myc—HisB为骨架首次构建了含有人源的EF1-α和polⅠ双启动子的载体pEZ，并通过报告基因证明其具有双向转录／表达的功能。此外，基于pEZ载体分别构建含有马流感病毒（EIV）A／equine／Jilin／1／1989（H3N8）（JL89）株各个节段cDNA的8个重组质粒，且其中HA节段通过点突变技术引入分子遗传标记（HindⅢ和NdeⅠ酶切位点）。将8个重组质粒共转染293T细胞，拯救出病毒（rJL89）。病毒滴度测定显示，拯救的第一代病毒具有较高的病毒滴度（2．38×10^5TCID50/mL）；序列分析表明，rJL89与JL89的各个节段的序列几乎一致性（99．9％～100％）；酶切鉴定表明，rJL89稳定携带分子遗传标记（HindⅢ和NdeⅠ酶切位点）；血凝效价测定表明，rJL89与JL89有相同的血凝效价（2^R）；生长动力学研究显示，rJL89具有与JL89相同的生物学特性。以上结果证明，基于pEZ载体建立了EIVJL89株的8质粒反向遗传系统，该系统可以拯救出较高滴度的病毒。本研究将为进一步开展EIV分子生物学研究提供有效平台。

问号钩端螺旋体毒力相关蛋白InvA转录和表达特征的研究

目的确定我国不同基因种问号钩端螺旋体（简称钩体）参考标准株携带毒力相关基因invA的情况，了解问号钩体赖株感染细胞前后invA基因转录和表达水平的变化。方法采用PCR检测4个不同基因种问号钩体株及双曲钩体PatocI株invA基因。克隆问号钩体全长irwA基因并测序，构建问号钩体黄疸出血群赖型赖株invA基因原核表达系统。Ni-NTA亲和层析法提纯目的重组蛋白rInvA后免疫家兔获得抗血清，免疫双扩散法检测其效价。建立问号钩体赖株感染人胚肾上皮细胞HEK293模型，采用荧光定量RT—PCR和Westernblot分别检测问号钩体赖株感染HEK293细胞前后invA基因的转录和表达水平的变化。结果4个不同基因种的问号钩体株均含有invA基因，双曲钩体PatocI株则否。4株不同基因种的问号钩体irwA基因核苷酸和氨基酸序列相似性分别为99．33％～100％和98．66％～100％。所构建的原核表达系统能有效地表达rInvA。rInvA兔抗血清免疫双扩效价为1：16。问号钩体赖株感染HEK293细胞30min以后可大量黏附于细胞表面。问号钩体赖株感染HEK293细胞30min时，invA基因mRNA水平明显上调，45min时达到峰值，然后逐渐下降。问号钩体赖株感染HEK293细胞后45min和60min时可检出InvA蛋白，感染前及感染90min以后检测结果均为阴性。结论invA基因是致病性问号钩体所特有的基因。invA基因具有宿主细胞接触式表达及瞬时表达的特点，与问号钩体侵人宿主细胞密切相关。