FOXP3基因3’-UTR段双荧光素酶报告载体的构建及其活性鉴定

目的:构建FOXP3基因3’-UTR双荧光素酶基因报告载体,并通过检测荧光素酶活性,初步分析可能调控FOXP3基因表达的miRNAs。方法:利用PCR方法,根据FOXP3基因3’-UTR序列信息设计其扩增引物,以293T细胞基因组DNA为模板PCR扩增FOXP3基因的3’-UTR序列,将其克隆到pmiRB-REPORT双荧光素酶报告载体中;运用Targetscan软件预测可能与FOXP3基因3’-UTR相互作用的miRNAs;利用LipofectaminTM2000试剂将miRNAs mimics与构建好的FOXP3基因3’-UTR段双荧光素酶报告载体共转染于常规培养的293T细胞中,然后使用双荧光素酶试剂盒检测荧光素酶活性,并与空白对照相比较。结果:经酶切及基因测序验证,成功构建含有FOXP3基因3’-UTR段双荧光素酶基因报告载体;Targetscan软件预测显示,FOXP3基因3’-UTR可能是miR-608的作用靶位点;双荧光报告显示,miR-608mimics组比空白对照组[(0.700 0±0.016 41)比(1.000±0.055 75)(P<0.001)]FOXP3基因3’-UTR双荧光素酶基因报告载体的荧光素酶活性下降30%。结论:FOXP3基因3’-UTR段双荧光素酶基因报告载体构建成功,初步证实miR-608对FOXP3有调控作用。

不良IVF结局患者NK细胞信号通路调节FoxP3细胞表达的研究

目的探讨IVF不良结局患者叉头样转录因子P3(FoxP3)细胞表达情况及NK细胞信号通路调节机制。方法选取我院自2018年1月至2019年1月间收治的75例IVF不良结局患者作为研究对象,依据失败类型分成3组:实施IVF≥3次均未获得妊娠者(反复失败组)25例、实施IVF后仅生化妊娠患者(生化妊娠组)25例、实施IVF后妊娠12周内胚胎停止发育/自然流产者(流产胚停组)25例;选取同期生育1次健康未孕女性25例作为对照组。所有受检者均于卵泡末期采集静脉血液,EDTA抗凝后密度梯度离心法分离血液中的单个核细胞(PBMC),再用免疫磁珠法分离血液中的NK细胞、CD4+CD25-Treg细胞,流式细胞分析各组NK细胞亚群活性;实时定量PCR检测4组受检者CD4+CD25-Treg细胞中FoxP3 mRNA表达情况,并分析肿瘤坏死因子-α(TNF-α)诱导的NK细胞对于CD4+CD25-Treg细胞表达FoxP3的影响。结果与健康对照组比较,IVF不良结局各组CD56+、CD56+CD16+NK细胞水平均显著升高(P<0.05);IVF不良结局组中流产胚停组CD56+NK细胞水平显著高于其他两组(P<0.05)。IVF不良结局各组CD4+CD25-Treg细胞FoxP3 mRNA表达水平均显著低于健康对照组(P<0.05),且不良结局组中反复失败组、生化妊娠组CD4+CD25-Treg细胞FoxP3 mRNA表达水平显著低于流产胚停组(P<0.05)。体外刺激实验显示TNF-α诱导NK细胞下调CD4+CD25-Treg细胞FoxP3的表达(P<0.05)。结论IVF不良结局患者外周血中CD56+、CD56+CD16+NK细胞水平显著升高,而Treg细胞中Fox3 mRNA水平显著降低,且NK细胞能够下调Treg细胞中FoxP3的表达。

不明原因复发性自然流产患者蜕膜组织中miR-21和miR-31的表达及其与FOXP3的相关性研究

目的研究微小核糖核酸-21(miR-21)、miR-31和叉头样转录因子P3(FOXP3)在不明原因复发性自然流产(URSA)患者蜕膜中的表达情况,探讨miR-21、miR-31与FOXP3之间的相关性。方法运用实时荧光定量PCR和蛋白免疫印迹法测定miR-21、miR-31及FOXP3在URSA患者及正常对照组蜕膜组织中的表达情况,并分析miR-21、miR-31的表达与FOXP3表达的相关性。结果FOXP3、miR-21在URSA组中的表达均明显低于正常对照组(P均<0.05),而miR-31在URSA组中的表达高于对照组(P>0.05)。蜕膜组织中miR-21,miR-31的表达与FOXP3的表达相关(P均<0.05),其中miR-21与FOXP3表达呈正相关,而miR-31与FOXP3表达呈负相关。结论蜕膜组织中miR-21和miR-31的表达异常,可能通过下调FOXP3基因的表达而引起母体免疫耐受机制紊乱,从而导致URSA的发生。

携带Foxp3基因慢病毒载体的构建

目的构建携带叉头样转录因子p3(Foxp3)基因的重组慢病毒载体PWPXL-MOD-Foxp3,并包装成慢病毒,为体外获得CD4+CD2+5调节性T细胞(CD4+CD2+5 Tregs)奠定基础。方法采用双酶切法构建慢病毒表达载体PWPXL-MOD-Foxp3,用磷酸钙沉淀法将包装慢病毒所需的四质粒系统共转染人胚肾细胞293T,慢病毒系统转染48h后收集病毒上清液,纯化、浓缩后采用流式细胞术测定慢病毒滴度。结果重组的慢病毒载体滴度为3.3×108IU/ml。结论成功构建了含有Foxp3基因的高滴度的慢病毒载体,为体外获得CD 4+CD 2+5 Tregs奠定基础。

重症肌无力患者FOXP3表达变化与体液免疫异常的相关性

目的探讨重症肌无力(MG)患者外周血叉头样转录因子P3(FOXP3)表达变化与体液免疫异常的关系。方法利用RT-PCR技术检测41例MG患者和20名体检健康者外周血单个核细胞FOXP3、B淋巴细胞激活因子(BLyS)、补体调节因子膜反应性溶解抑制物(CD59)和衰变加速因子(DAF)的mRNA表达,用ELISA法检测外周血清转化生长因子(TGF-β1)、抗乙酰胆碱受体抗体(anti-AChR-IgG)水平,并进一步分析其间的关系。结果(1)MG患者组外周血FOXP3、CD59、DAF的mRNA表达及血清TGF-β1水平明显低于健康对照组,BlySmRNA表达水平明显高于健康对照组(均P<0.01);(2)外周血FOXP3、BLyS、CD59、DAF的mRNA表达及血清TGF-β1水平,在眼肌型与全身型MG患者间差异无统计学意义;(3)41例MG患者中血清抗AChR-IgG阳性30例,眼肌型(18例)和全身型(12例)血清抗AChR-IgG水平差异无统计学意义(P>0.05);(4)MG组外周血单个核细胞FOXP3 mRNA表达与血清TGF-β1水平及CD59、DAF mRNA表达水平呈正相关(分别r=0.84,P<0.01;r=0.455,P<0.05;r=0.435,P<0.05),与BLyS mRNA表达呈负相关(r=-0.58,P<0.05);血清抗AChR-IgG抗体阳性患者中,抗AChR-IgG抗体水平与FOXP3 mRNA表达水平、血清TGF-β1水平呈负相关(分别r=-0.77、r=-0.81,均P<0.01),而与BLyS mRNA表达水平呈正相关(r=0.757,P<0.01),与CD59、DAF mRNA水平无相关性(P>0.05)。结论 FOXP3 mRNA、TGF-β1低表达可能促进B细胞活化,进而通过增加AChR抗体产生及抑制补体调节蛋白活化促进体液免疫,在MG发病中起重要作用。

氧化苦参碱调控CTLA-4和PD-1缓解小鼠类风湿关节炎的作用

目的 观察氧化苦参碱(oxymatrine,OMT)通过免疫负调控机制对小鼠胶原诱导性关节炎(collagen-induced arthritis,CIA)的缓解作用。方法 将DBA/1J小鼠随机分为正常组、模型组、OMT组和地塞米松组,每组9只。采用胶原和佐剂等体积混合背部皮下多点注射诱导DBA/1J小鼠,构建CIA小鼠模型。OMT组和地塞米松组分别用氧化苦参碱和地塞米松进行腹腔注射,正常组注射同等剂量的生理盐水。采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法检测脾淋巴细胞叉头样转录因子P3(forkhead box protein3,Foxp3)、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白-4(cytotoxic T-lymphocyte-associated protein-4,CTLA-4)和程序性死亡受体-1(programmed cell death protein-1,PD-1)的mRNA表达水平。采用苏木精-伊红染色法(hematoxylin-eosin staining,HE)观察关节滑膜组织的异位生发中心。采用免疫组织化学法和Western blot检测Foxp3及CTLA-4和PD-1的表达。结果 OMT可缓解CIA小鼠关节肿胀度并降低其关节评分,增加脾淋巴细胞和关节组织Foxp3及CTLA-4的表达,降低PD-1的表达(P均<0.05),并减少炎性细胞大面积浸润。结论 OMT可能经增加调节性(Foxp3+)T细胞CTLA-4的表达但降低PD-1的表达而缓解RA。

抑郁症中糖皮质激素受体与CD4^+ CD25^+调节性T细胞的关系及其所致免疫失衡机制的初步探讨

目的研究抑郁症患者外周血细胞因子白介素-10(IL-10)、转化生长因子β(TGF-β)的变化、CD4+ CD25+调节性T细胞(Treg)的数量及其特征性标志叉头样转录因子P3(Foxp3)的表达与糖皮质激素受体(GR)的表达之间的关系,探讨抑郁症患者免疫失衡的可能机制。方法纳入36例抑郁症患者和36名正常对照,根据Hamilton抑郁量表总分将患者划分为轻、中和重不同抑郁程度组;利用ELISA方法测定受试者外周血血清细胞因子IL-10、TGF-β浓度;逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测GR的α及β两种亚型(GRα、GRβ)、Foxp3 mRNA表达水平;免疫磁珠分离CD4+ CD25+ Treg,共聚焦显微镜观察Foxp3与GR在CD4+ CD25+ Treg上的共表达。结果与正常对照组比较,患者组血清IL-10、TGF-β的水平降低(P<0.05),外周血CD4+CD25+Treg数量及在CD4+T细胞中的比例明显少于对照组(P<0.01),且重度抑郁组上述指标明显低于中度和轻度抑郁组(P<0.01)。抑郁各组单个核细胞GRαmRNA和FoxP3 mRNA表达水平随抑郁程度而降低(P<0.01),GRβmRNA却在重度抑郁组表达增加。共聚焦显微镜下可观察到重度抑郁患者CD4+ CD25+ Treg上GR与Foxp3表达显著减少。结论糖皮质激素受体可能通过影响调节性T细胞的功能和数量在抑郁症患者免疫失衡的病理生理机制中发挥着重要的作用。

Graves病中调节性T细胞功能的改变

目的探讨Graves病发生的免疫机制,了解调节性T细胞在其发病中的作用。方法流式细胞术检测32例Graves病(GD组)和20例正常人(正常对照组)中CD4+CD25+T细胞的比例。免疫磁珠法(MACS)分离CD4+CD25+细胞,酶联免疫吸附(ELISA)法检测IL-10的水平,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测FOXP3的表达。结果与正常对照组相比,GD组CD4+CD25+T细胞数量无明显改变(P=0.804),而FOXP3表达减少(24 h和48 h P均<0.01),IL-10分泌减少(24 h和48 hP均<0.01)。结论GD患者调节性T细胞在外周血淋巴细胞中的比例虽无明显改变,但其功能明显减弱,可能是导致其发病的原因之一。