LEC1等转录因子基因在花生小种子突变体种子发育过程中的表达分析

花生突变体ssm1与其对照亲本鲁花11号(LH11)相比,种子皱缩变小,百仁重、单株生产力和含油量显著降低。为了探究导致该突变体种子变小且含油量降低的原因,本试验研究了种子发育关键转录因子基因LCE1等在突变体ssm1及其对照LH11合子受精及种子发育不同阶段的表达情况。结果表明,AhLEC1在花生未受精子房(DBP0)时期表达量较低,且在ssm1和对照LH11中无明显差异,在受精后的子房(DBP1)和入土10 d(DAP10)和20 d(DAP20)种子中表达量上调,并且在LH11中的表达量极显著高于突变体ssm1;转录因子基因AhFUS3、AhABI3、AhAGL15和AhWRI1在ssm1中表达均有不同程度下调。其中,与脂肪酸合成和糖酵解关系密切的AhWRI1基因在ssm1中的表达量显著下调。因此推测,ssm1中AhLEC1基因的表达量显著下调,影响AhFUS3、AhABI3和AhWRI1等基因的表达,进而导致ssm1种子胚胎发育和油脂积累的异常。

葡萄VvCCD1b基因克隆及与其启动子互作的转录因子筛选

【目的】筛选葡萄类胡萝卜素裂解双加氧酶(CCD)基因VvCCD1b启动子互作的转录因子,挖掘参与调控葡萄类胡萝卜素代谢的潜在因子,为深入探究葡萄类胡萝卜素的代谢调控网络提供理论参考。【方法】克隆VvCCD1b基因的cDNA及其启动子序列,利用生物信息学软件对VvCCD1b基因的染色体位置、启动子顺式作用元件及其编码蛋白的理化性质、保守结构域等进行预测分析。基于转录组数据分析不同葡萄品种及不同处理下葡萄CCD家族成员表达模式。通过酵母单杂交技术筛选与VvCCD1b基因启动子互作的转录因子,并进行点对点验证。【结果】通过PCR克隆获得VvCCD1b基因序列全长1641 bp,位于13号染色体上,编码546个氨基酸残基,为亲水性蛋白,二级结构由α-螺旋(16.67%)、β-折叠(5.49%)、延伸链(24.54%)和无规则卷曲(53.30%)构成,具有RPE65保守结构域。VvCCD1b基因启动子含有光响应元件(G-box、3-AF1 binding site、GATA-motif、TCT-motif)、水杨酸(SA)响应元件(SARE)、脱落酸(ABA)响应元件(ABRE)及AP2/ERF、WRKY、MADS-box转录因子结合元件。VvCCD1b基因表达水平随果实发育逐渐升高且受光照与逆境胁迫的影响。以VvCCD1b基因启动子为诱饵,初步筛选出VvRAP2-4、VvWRKY4、VvBHLH137转录因子及葡萄液泡加工酶、葡萄糖苷酶等18个功能蛋白,其中VvRAP2-4、VvWRKY4转录因子与VvCCD1b基因启动子间存在互作。【结论】VvCCD1b为亲水性蛋白,基因表达水平随果实发育逐渐升高,且受到干旱、高温、水涝胁迫和光照的影响。通过酵母单杂交技术筛选出与VvCCD1b启动子互作的候选转录因子。

独行菜种子bHLH类转录因子基因家族及幼苗laICE1表达对冷胁迫的响应

该研究在转录组数据基础上,以独行菜(Lepidium apetalum Willd.)种子耐受和不能耐受低温萌发的2组样本为材料,对其bHLH转录因子家族成员进行分析,并对该家族成员表达差异极显著的laICE1基因进行克隆、序列分析、结构预测,以探讨独行菜幼苗中laICE1基因表达对低温胁迫的响应特征。结果表明:(1)萌发中的独行菜种子,至少有83个bHLH转录因子序列表达,相对于低温萌发停滞组,在低温萌发耐受组的独行菜种子中,有10个下调、13个上调、60个表达差异不显著。其中表达量极显著下调的序列c20009_g1具有1 503bp开放阅读框,GO注释到ICE1基因,该基因命名为laICE1。(2)laICE1基因编码500aa,蛋白分子量为54 635.19kD,理论等电点为5.45,分子式为C2364H3742N688O758S22;该蛋白具有保守结构域bHLH。(3)定量分析表明,laICE1基因在非低温胁迫的独行菜种子中的表达量显著低于一直处于低温胁迫中不能进行萌发的独行菜种子,这与转录组数据库中该序列表达情况一致;而laICE1基因在独行菜幼苗期经低温处理后,其表达量显著上调,表明laICE1基因可能在独行菜幼苗耐受低温生长中具有一定的作用。

条锈菌诱导的小麦MBF1转录辅激活因子基因的克隆及其特征分析

应用电子克隆和RT-PCR方法,从小麦叶片中分离出一个条锈菌诱导的编码MBF1基因的cDNA序列,暂被命名为TaMBF1a。TaMBF1a包含一个完整的429 bp的开放阅读框,编码142个氨基酸,具有MBF1保守结构域;小麦TaMBF1a氨基酸序列与水稻OsMBF1相似性达92%,与拟南芥AtMBF1a相似性达80%。TaMBF1a编码的蛋白可能是核蛋白,且该基因在小麦根、茎、叶组织中表达量基本一致。在小麦与条锈菌的亲和、非亲和互作中,TaMBF1a基因均受条锈菌诱导高水平表达,且非亲和组合表达量高于亲和组合。外源植物激素水杨酸、乙烯、脱落酸也可诱导该基因快速上调表达,表明TaMBF1a可能通过水杨酸、乙烯等信号途径参与小麦对条锈菌的防御反应。

转录因子DREB1A基因和Bar基因双价植物表达载体的构建及对马铃薯遗传转化的研究

马铃薯在生长发育过程中受各种生物和非生物胁迫的影响,干旱是其中最常见和危害最严重的非生物胁迫因素之一,常常导致单产不高,总产不稳,严重影响着马铃薯产业的发展。本研究以改善马铃薯抗旱性为目的,采用PCR方法从拟南芥中克隆了转录因子DREB1A基因和诱导型启动子rd29A。利用DNA重组技术成功构建了诱导型启动子rd29A驱动转录因子DREB1A基因和CaMV35S启动子驱动Bar基因的双价植物表达载体pBI121-rd29-BDR,并通过农杆菌介导法对马铃薯进行遗传转化,PPT筛选得到22株抗性苗,PCR和RT-PCR检测证明DREB1A基因已整合到陇薯10号马铃薯基因组中并在转基因植株中转录表达,有望提高转基因马铃薯的抗旱性。目前,作者正在进行转基因马铃薯的抗旱性分析研究。

ERF类转录因子OPBP1基因的超表达提高烟草的耐盐能力

ERF是植物中的一类重要的转录因子 ,参与调节植物的生长、发育以及抗胁迫等过程。对一烟草OPBP1基因 (属于ERF类基因 )的烟草转化 ,获得了该基因超表达的植株 ,转基因植株明显地增加了耐盐能力。Northern杂交结果表明 ,OPBP1基因有不同程度的表达 ,而且表达丰度与其耐盐性有一定的正相关性。凝胶阻滞实验结果证明OPBP1融合蛋白能特异地与含GCC盒的DNA序列结合。这些结果说明OPBP1基因可能作为一转录因子来调节烟草耐盐相关的基因。

MDV感染B19、B21单倍型SPF鸡外周血淋巴细胞BLec1、BNK及细胞因子基因转录水平比较

本研究旨在揭示BLec1、BNK及细胞因子在B21和B19两种单倍型鸡对马立克病(MD)抗性差异中的可能机制。分别对B21和B19单倍型1日龄鸡腹腔接种马立克病毒(MDV)超强毒株,在攻毒后不同时间检测鸡外周血淋巴细胞中BLec1、BNK及IFN-γ、IL-4、IL-10和IL-18的基因转录水平。结果显示,在第4、7天,两种鸡BNK、BLec1和4种细胞因子水平表现出不同程度的降低。在第10天,B21单倍型鸡中BNK、BLec1、IFN-γ、IL-4和IL-18基因转录量出现不同程度的升高,而B19单倍型鸡中细胞因子转录水平有所下降。在第13天,B21单倍型鸡中BNK、BLec1、IL-18和IL-10基因转录量表现出不同程度的升高,而B19单倍型鸡中则有所下降。以上结果总体表明,MD耐受型鸡在感染沉默期BNK、BLec1和细胞因子转录量高于敏感型,不同遗传基因型鸡对MD的抗性差异与耐受基因及细胞因子的转录情况有着密切的关系。

胡萝卜低温胁迫转录因子DcICE1基因克隆与非生物逆境响应分析

植物ICE1基因是调控CBF基因表达的上游调控因子,在植物抵抗逆境胁迫中具有重要的作用。该实验以2个胡萝卜品种‘黑田五寸’和‘君川红’为实验材料,分别克隆出DcICE1转录因子基因,并通过荧光定量PCR方法测定了4种不同逆境胁迫下(4℃低温、38℃高温、0.2mol·L-1 NaCl及200g·L-1 PEG)DcICE1基因的表达情况,探讨DcICE1转录因子在植物抵抗非生物胁迫下的功能。序列分析显示,该基因全长1 458bp,编码485个氨基酸。2个胡萝卜品种的DcICE1基因在核苷酸水平上有2个位点的差异,分别为第139位的G/A和第475位的A/G,导致编码的氨基酸在第47位的E/K和第159位的N/D差异,该差异可能与DcICE1转录因子在2个不同品种应对逆境胁迫下的响应不同有关。胡萝卜DcICE1转录因子有一个保守的ICE1功能结构域。实时定量PCR检测DcICE1基因在不同逆境胁迫下的响应表明,低温(4℃)处理能明显地诱导DcICE1基因的表达,但盐(0.2mol·L-1 NaCl)和干旱(200g·L-1 PEG)处理下的诱导效果均不明显。

转录因子DREB1A基因的克隆与植物表达载体的构建

根据GenBank中已发表的转录因子DREB1A基因的cDNA序列设计并合成了一对引物 ,通过RT PCR的方法从低温处理的拟南芥总RNA中扩增出DREB1A基因的全长cDNA片段。将其克隆到 pMD1 8T vector中。经测序证明该片段与GenBank上报道的序列具有 99.8%的同源性。 2个碱基的置换导致了一处氨基酸的差异 ,但这一氨基酸并不在基因的功能结构域上 ,推测其不会影响基因功能。以植物表达载体pBch为基础 ,构建了由组成型启动子 35S调控的DREB1A基因的植物表达载体pBDR35S 。

桑树转录因子CBF1基因的克隆及序列特征与低温应激表达

CBF(C-repeat binding factor)是一类与植物抗逆应答相关的转录因子。利用RT-PCR和RACE技术克隆桑树CBF1基因的全长cDNA序列,命名为MCBF1(GenBank登录号:JX186750)。该基因序列全长1 134 bp,包括693 bp的开放阅读框,87bp的5'端非翻译区和354 bp的3'端非翻译区;预测其编码的氨基酸序列具有保守的AP2结构域,且该结构域的两端拥有CBF家族特有的短多肽序列PKK/RPAGRxKFxETRHP和DSAWR,与其它植物CBF1的序列相似性较高;基于CBF1序列的系统进化树显示桑树与柑橘(Citrus jambhiri)、垂枝桦(Betula pendula)和切花月季(Rosa hybrid cultivar)的亲缘关系较近。将构建的pET28a-MCBF1原核表达载体转化大肠杆菌BL21后,诱导表达的MCBF1重组蛋白分子质量大小与预测值一致。半定量RT-PCR分析MCBF1基因在未经过低温处理的对照桑苗幼叶中无表达,而在低温处理后的桑苗幼叶中有表达,其中低温处理4 d后的表达量最高。克隆的MCBF1基因编码蛋白质具有典型的CBF家族结构域,并具有低温诱导表达的特点,推测其在桑树对低温的耐受性中发挥作用。

干旱响应转录因子DREB1A基因导入水稻光温敏核不育系的研究

以成熟胚诱导的愈伤组织作为农杆菌转化的受体材料,将诱导型启动子rd29A驱动的拟南芥DREB1A基因导入粳型光温敏核不育系水稻4008S,共获得67株再生苗.再生苗经0.75mg/L除草剂草铵膦涂布筛选,有62株再生苗表现出对草铵膦抗性.PCR检测抗性苗中DREB1A基因,结果全为阳性.挑选部分进行Southern检测,结果表明目的基因已经整合到水稻基因组中.在干旱胁迫下,转基因水稻当代(T1代)植株的电导率显著低于非转基因对照植株(P<0.05),脯氨酸含量显著高于对照植株(P<0.05),证明DREB1A基因能提高水稻对干旱胁迫的耐受性.

应用人延伸因子1α亚基启动子和人工转录激活因子提高外源基因在CHO细胞中的表达

表达载体的设计对于提高外源基因在哺乳动物细胞中的表达量十分重要 .而表达载体中最为重要的元件是启动子 .一些常用病毒来源的启动子 ,如巨细胞病毒即早期启动子 (PCMV IE)仅在S期激活 ,应用这类启动子表达外源蛋白需要宿主细胞不停增殖 ,这对于连续持久大规模培养的宿主细胞不现实 .而人延伸因子 1α亚基启动子 (PEF 1α)不受细胞周期限制 ,且启动子强度高于PCMV IE,对于大规模外源蛋白的生产较为理想 .首先构建了基于PEF 1α启动子的哺乳动物细胞表达载体pED5 ,在增殖缓慢的CHO细胞中 ,此载体表达外源蛋白的能力是应用PCMV IE启动子表达载体的 4 1倍 .由于启动子一般仅能决定基因转录的本底水平 ,而转录激活因子 (transcriptionactivators)对基因转录的影响更大 ,所以另把两个人工转录激活结构域AH和VP2接到λ噬菌体cⅠ蛋白的C端 ,它们通过cⅠ蛋白结合于已插入到PEF 1α启动子的TATA框上游约 2 0 0bp的λ噬菌体OR2 OR1序列上 ,而被“征募”到PEF 1α启动子TATA框附近 ,从而促进基因的转录 .把上述元件均整合进一个表达载体中 ,构建了两个新型表达载体pER AH和pER VP2 .pER AH表达外源蛋白的能力比不含转录激活因子的表达载体略高 ,而pER VP2表达外源蛋白的能力则比不含转录激活因子的表达载体高

F10基因对转录因子NF-κB、AP1活性的影响

目的:研究F10基因对转录因子NF-κB、AP1活性的影响。方法:质脂体共转染F10基因和报道质粒NF-κB-Luc、AP1-Luc,通过测定荧光素酶的活性以确定F10基因对NF-κB和AP1转录活性的影响;提取各实验组不同时点细胞核蛋白,用电泳迁移率改变实验(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)检测AP1、NF-κB和DNA的结合活性。结果:F10基因瞬间转染A549细胞48h NF-κB-Luc和AP1-Luc荧光素酶的活性较其对照组分别下降0.3和上升2倍、AP1和NF-κB与DNA的结合活性分别上升23%和下降49%。结论:F10基因上调AP1活性、下调NF-κB的活性。

转化生长因子β1对人牙本质基质蛋白1基因转录活性的影响

目的:观察具有矿化活性的人牙髓干细胞(human dental pulp stem cell,HDPSC)在重组人转录生长因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)作用下对牙本质基质蛋白1(dentin matrix protein1,Dmp1)表达和Dmp1基因启动子转录活性的影响。方法:通过建立体外培养的HDPSC矿化诱导模型,经10ng/L重组人TGF-β1刺激后,运用RT-PCR、报告基因检测等方法检测细胞在TGF-β1作用后Dmp1mRNA表达变化以及对pGL3-P-193～+86和pGL3-P-505～+862个启动子片段重组报告基因载体活性的影响。结果:诱导矿化后具有部分成牙本质细胞样细胞特征的HDPSC经TGF-β1刺激后,Dmp1mRNA的表达水平明显下降,并存在时间依赖性。pGL3-P-193～+86和pGL3-P-505～+86相对荧光素酶活性均下降,以pGL3-P-505～+86活性下降更明显,说明TGF-β1具有下调HDPSCDmp1转录活性的作用。计算机分析结果发现,Dmp1基因启动子-505～+86bp区存在多个TGF-β1下游作用分子Smads的结合位点。结论:TGF-β1可下调Dmp1mRNA的表达水平和转录活性,以pGL3-P-505～+86活性下降更明显。启动子-505～-193bp区存在TGF-β1下游作用分子或转录因子的结合位点,从而参与下调Dmp1转录表达过程。

B7-1与B7-2对调节人IL-2基因的转录因子NF-κB和AP-1的相同作用

为了解B7共刺激对细胞因子 ,特别是对IL 2mRNA及转录因子NF κB和AP 1的影响 ,探讨B7介导的IL 2调节的分子机制 ,在异基因混合淋巴细胞反应 (MLR)体系中分别或联合加入抗B7 1、抗B7 2单克隆抗体和CTLA 4Ig以阻断B7/CD2 8信号传导 ,通过竞争性PCR定量检测其对IL 2和IL 4mRNA的影响 ,并初步测定IFN γmRNA的改变 ,同时用转染MHCⅡ类分子及联合转染等量B7 1或B7 2的NIH3T3转基因细胞tDR7,tDR7/B7 1和tDR7/B7 2刺激CD2 8+ T细胞 ,通过DNA 蛋白结合实验观察B7对IL 2转录因子NF κB和AP 1的影响。结果表明 :抗B7 2单抗和CTLA 4Ig可明显抑制B7介导的IL 2和IL 4mRNA合成 ,而抗B7 1单抗仅有轻度抑制作用 ,2种或 3种抗体联合应用时抑制作用相加。MLR 1 - 6小时 ,单独tDR7即可诱导NF κB的表达 ,联合转染B7早期对其结合活力无明显影响 ,6小时后tDR7诱导作用减弱 ,B7却可显著延长tDR7的诱导作用至 72小时。tDR7早期同样可诱导AP 1的表达 ,联合转染B7分子在 2 4小时内对其有一定的抑制作用 ,而在反应后期可延长tDR7对AP 1的上调作用 ,B7 1与B7 2间作用未见明显不同。结论 :B7通过减少IL 2mRNA降解和影响基因转录而上调IL 2分泌 ,并可同时影响多种细胞因子分泌 ;在转录水平B7 1与B7 2作用未见明显不同 。

苜蓿转录因子基因Mfhb-1的生物学功能初探

以苜蓿转化植株为材料,利用苜蓿的直接体细胞胚胎发生体系,对苜蓿HD-Zip转录因子基因Mfhb-1的生物学功能进行了初步研究。结果发现,正义转化植株F4(转入基因编码区序列)产生体细胞胚胎时期较对照47/1-5反义转化植株D3(转入编码区的反向序列)和C5(转入编码区+uORF)早,且形成的体细胞胚胎数量远高于对照47/1-5;D3植株产生的体细胞数量较对照少;C5植株产生的体细胞数量较对照少,但比D3稍多。从以上结果可以推测,属于HD-Zip转录因子的Mfhb-1基因能够促进苜蓿体细胞胚胎的发育,并能够提高苜蓿体细胞胚胎发生的数量。

甲状旁腺激素对大鼠成骨细胞转化生长因子-β_1基因转录的影响

目的:探讨甲状旁腺激素(PTH)对大鼠成骨细胞(ROB)的转化生长因子-β1-(TGF-β1)基因转录的影响。方法:ROB被分成3组培养:(1)对照组,在每个培养周期(48h)的前6h和后42h的培养液中均不加PTH;(2)PTH间歇刺激组(间刺组),仅在前6h的培养液中加PTH;(3)PTH持续刺激组(持刺组),前6h和后42h的培养液中均加PTH。第3周期细胞内mRNA含量用RT-PCR测定。结果:第3周期细胞内mRNA含量变化情况为:第6小时以间刺组最高,其余二组相似;第24小时依次是间刺组>对照组>持刺组;第48小时间刺组与对照组相似,持刺组最低。结论:PTH间歇与持续刺激对TGF-β1基因转录均有明显影响,该基因转录增强可能是PTH间歇刺激促成骨机制之一。

巢湖鸭生长素基因和垂体特异性转录因子1基因的PCR-SSCP检测

以生长素基因Ghrelin和垂体特异性转录因子1Pit-1基因为候选基因,采用PCR-SSCP和DNA测序技术检测2个候选基因在巢湖鸭群体中的单核苷酸多态性(SNPs)。结果表明,Ghrelin基因exon 3第54 bp位置有G→A碱基的点突变,在巢湖鸭群体中检测到AA、AB、BB 3种基因型,A等位基因频率为0.49,B等位基因频率为0.51;在exon 5第149位和166位发生了C→A和G→T的突变,检测到MM、MN、NN 3种基因型,M等位基因频率为0.19,N等位基因频率为0.81。Pit-1基因的2对引物的扩增片段均未检测到多态性,说明所检测的Pit-1基因外显子3和4序列比较保守。

核心结合因子α1对牙本质涎磷蛋白基因转录调控的影响

目的观察核心结合因子α1(corebindingfactorα1,cbfα1)对牙本质涎磷蛋白(dentinsialophosphoprotein,DSPP)基因启动活性的影响。方法选择小鼠成牙本质细胞样细胞MDPC-23为实验细胞,DSPP基因上游2.6kb片段(-2475bp～+53bp)为启动子。通过采用瞬时转染、报告基因等方法,用SPSS10.0统计软件包对结果进行统计学分析,观察在MDPC-23中,cbfα1对DSPP基因启动子启动活性的影响。结果在MDPC-23细胞中,pGL3-Enhancer-2.6K+pcDNA3-cbfα1共转染组荧光素酶的表达量显著小于pGL3-Enhancer-2.6K+pcDNA3共转染组(P<0.01)。结论cbfα1对DSPP基因上游-2475bp～+53bp区域的启动活性有抑制作用。

稻曲病病菌Zn_(2)(Ⅱ)Cys6型转录因子UvZC1基因的克隆及功能分析

为明确Zn_(2)(Ⅱ)Cys6型转录因子UvZC1在稻曲病病菌中的功能,利用CRISPR-Cas9结合同源片段双交换的方法,诱导野生型菌株Jt209发生UvZC1基因缺失突变。结果显示,与Jt209相比,UvZC1基因缺失突变体的生长速率和分生孢子量均显著下降,且突变体中部分与稻曲病病菌其他产分生孢子相关基因表达量发生变化;此外,该基因的缺失导致突变体对十二烷基硫酸钠(SDS)更敏感,而对氧化胁迫的耐受性增强;在稻曲病病菌接种水稻后24 h、48 h的侵染早期,UvZC1基因的表达量明显上升,但基因缺失突变体接种水稻后形成的稻曲球数量与野生型之间没有差异。综上所述,UvZC1基因参与稻曲病病菌营养生长、分生孢子产生和侵染水稻过程,还与稻曲病病菌细胞壁的完整性和响应氧化胁迫相关。