转录因子腺病毒E4启动子结合蛋白4在肿瘤中的研究进展

腺病毒E4启动子结合蛋白4(E4BP4)是一种含有碱性亮氨酸拉链的转录因子,在乳腺癌、肺癌、甲状腺癌、结直肠癌等多种恶性肿瘤中高表达,参与肿瘤的发生发展、转移和侵袭,但关于E4BP4在肿瘤研究中的相关综述较少。本文检索并总结相关文献,概述了E4BP4在不同肿瘤发生发展中的作用,为深入研究E4BP4在肿瘤中的作用机制以及基于E4BP4分子治疗靶点的探究提供理论支撑。

DBP及E4BP4对拓扑异构酶Ⅰ的转录调节作用

目的探讨DBP(D site of albumin promoter(albumin D-box)binding protein)及E4BP4(腺病毒E4启动子结合蛋白-4)是否参与拓扑异构酶Ⅰ(TOPOⅠ)的调节作用。方法运用荧光素酶转录活性测定DBP和E4BP4对mTopoⅠ的转录活性,凝胶阻滞分析检测DBP及E4BP4蛋白和TopoⅠ核酸相互作用。结果荧光素酶转录活性测定实验显示DBP及E4BP4均能促进TopoⅠ基因的转录活性;凝胶阻滞分析实验直接证实DBP及E4BP4与TOPOⅠ启动子区域D-box活性区域结合发挥活性作用。结论 DBP及E4BP4参与调节拓扑异构酶Ⅰ的表达。

细胞动粒蛋白Hec1启动子的结构及功能分析

细胞的分裂是一个严格调控,高度有序的过程.为了将复制后的染色体均匀、准确地传递给两个子细胞,细胞在分裂中后期受到纺锤体检验点的严格监控.Hec1定位于动粒,是纺锤体检验点调控的关键蛋白之一,它通过螺旋-螺旋结构域与其他动粒蛋白相互作用调节姐妹染色体的精确分离.为研究Hec1转录水平的调控机理,采用BLAST工具,从GenBank中搜索到了人Hec1基因上游的序列,并利用在线工具http://mbs.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH.html提供的转录因子结合位点搜索引擎,对其5′启动子调节区段进行了分析.分析结果表明:在Hec1基因上游-200～-1序列内,存在E2F、ATF4和cAMP应答元件结合蛋白(CREB)等转录因子调控元件.在结构分析的基础上,提取HeLa细胞基因组DNA,用PCR方法克隆了Hec1基因启动子,并构建了多个含启动子不同区段的pGL3荧光素酶报告基因表达质粒.瞬时转染HeLa细胞后的结果表明,-70～-63以及-155～-144之间的启动子区对维持荧光素酶活性最为关键.凝胶迁移实验证明,这两个区段分别能够和转录因子CREB以及ATF4结合.随后,采用野生型的以及含有133位磷酸化位点突变的CREB转染HeLa细胞,通过荧光定量PCR实验发现,Hec1的表达水平分别出现明显上升和下降.该结果表明,Hec1表达的调控是通过CREB的活化来完成的.

C-myb蛋白、4E-BP1蛋白在NK/T细胞淋巴瘤中的表达与预后的关系

目的探讨转录激活因子Myb(C-myb)、真核细胞翻译起始因子4E结合蛋白-1(4E-BP1)蛋白在NK/T细胞淋巴瘤中的表达及与预后的关系。方法回顾性选取2017年12月至2019年12月在秦皇岛市第一医院治疗的NK/T细胞淋巴瘤患者34例作为观察组,同时选取腺样体肥大组织30例作为对照组。采用免疫组织化学法检测C-myb、4E-BP1表达,比较两组患者C-myb、4E-BP1表达情况,分析观察组C-myb、4E-BP1表达与临床病理关系。采用Spearman秩相关分析C-myb和4E-BP1表达相关性。随访患者总体生存时间,分析C-myb、4E-BP1表达与预后的关系。结果观察组C-myb和4E-BP1阳性表达率分别为55.88%和61.76%,明显高于对照组(10.00%、6.67%),差异均有统计学意义(P<0.05)。临床分期Ⅲ~Ⅳ患者C-myb阳性表达率为91.67%,明显高于Ⅰ~Ⅱ患者(36.36%),差异有统计学意义(P<0.05);不同性别、年龄、原发部位、B症状、国际预后指数(IPI)指数及淋巴结侵犯患者C-myb阳性表达率比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。IPI指数≤2分患者4E-BP1阳性表达率为76.00%,明显高于IPI指数>2分患者(22.22%),差异有统计学意义(P<0.05);不同性别、年龄、原发部位、B症状、临床分期及淋巴结侵犯患者4E-BP1阳性表达率比较,差异均无统计学意义(P>0.05);C-myb和4E-BP1表达呈正相关(r_(s)=0.642,P<0.05);C-myb阳性表达和阴性表达患者中位总生存时间比较,差异无统计学意义(P>0.05);4E-BP1阳性表达患者中位总生存时间为24个月(95%CI:21.15~26.85),明显短于4E-BP1阴性表达患者的33个月(95%CI:32.20~33.80),差异有统计学意义(P<0.05)。结论NK/T细胞淋巴瘤中C-myb和4E-BP1蛋白表达上调,与临床分期、IPI指数有一定关系,其中4E-BP1表达与患者预后可能有一定联系。

CHD4基因表达对急性T淋巴细胞白血病细胞增殖和凋亡的影响及其启动子鉴定

目的:探讨人染色质解旋酶DNA结合蛋白4(recombinant chromodomain helicase DNA binding protein 4,CHD4)基因表达对急性T细胞淋巴细胞白血病细胞增殖和凋亡的影响及其启动子鉴定。方法:使用siRNA-CHD4瞬时转染T淋巴细胞白血病细胞(Jurkat)敲低CHD4基因表达,实时荧光定量q RT-PCR和Western blot检测细胞转染后CHD4表达量,流式细胞术测定细胞凋亡率及细胞周期变化;CCK-8分析测定CHD4基因对Jurkat细胞增殖的影响。根据生物信息学分析,以Jurkat细胞提取的全基因组DNA为模板,PCR扩增CHD4基因候选启动子区2 091 bp片段,以pGL3-Basic为载体,克隆含有CHD4基因候选启动子区的序列,制备重组质粒,并且构建一系列含CHD4基因候选启动子5′侧翼区截短序列质粒。将含CHD4启动子序列的质粒及截短序列质粒转染至Jurkat细胞和人胚胎肾T细胞(HEK293T),双荧光素酶报告基因检测各片段的启动子活性,确定CHD4基因启动子最小活性区域,并通过生物信息学方法分析该区域转录因子结合位点,构建结合位点突变的质粒,通过双荧光素酶报告基因检测,分析结合位点对CHD4转录的影响。结果:流式细胞检测结果发现,与对照组比较,CHD4抑制Jurkat细胞凋亡,转染siRNA-CHD4的Jurkat细胞G0/G1期比例显著升高,而S期比例下降(P<0.01);CCK-8检测CHD4基因对Jurkat细胞的增殖有促进作用(P<0.05);成功构建含有CHD4基因候选启动子序列的质粒及其截短序列质粒,与pGL3-Basic空载体相比,含有CHD4基因候选启动子序列的质粒活性明显增加(P<0.05)。CHD4基因最小活性区域位于转录起始位点-233~-13 bp,其中包含NF-κB、MZF1等转录因子结合位点;NF-κB对CHD4启动子活性具有正向调控作用。结论:CHD4基因对Jurkat细胞凋亡有抑制作用,并且促进其增殖。CHD4最小活性区域位于转录起始位点-233~-13 bp,转录因子NF-κB对CHD4基因启动子活性具有正向调控作用。

hnRNP K shRNA对K562细胞效应的初步研究

目的:探索RNA结合蛋白K(Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K,hnRNP K)shRNA逆转录病毒对K562细胞的效应。方法:HindⅢ/EcorⅠ双酶切和测序鉴定pSUPER retro hnRNP K shRNA逆转录病毒载体,用包装得到的逆转录病毒感染K562细胞,G418稳定筛选后,分别用流式细胞仪,MTT实验,瑞氏染色,RT-PCR分析细胞周期和细胞凋亡,细胞增殖,细胞形态学,hnRNP K和真核细胞翻译起始因子4E(Eukaryotic translation initiation factor-4E,eIF4E)mRNA表达变化。结果:克隆载体序列正确。与空载对照组K562细胞相比,hnRNP K干扰组G2/M期细胞比例明显增多(P<0.05),而细胞凋亡则没有显著变化(P>0.05),细胞增殖能力降低,双核和多核细胞明显增多(P<0.05),hnRNP K和eIF4E mRNA表达较空载对照组分别降低了55.22%和55.27%。结论:hnRNP K基因沉默能使K562细胞周期阻滞于G2/M期,对细胞凋亡没有显著影响,降低细胞增殖能力,下调eIF4E mRNA表达,使双核和多核细胞增多,提示该基因可能与细胞分裂有关。