转录因子AP-2α对人结肠癌细胞增殖的抑制作用及其机制

目的:研究转录因子活化蛋白-2α(transcription factor activator protein-2α,AP-2α)对人结肠癌SW480细胞增殖的抑制作用及其相关机制。方法:构建pcDNA3.1(+)-AP-2α重组质粒,利用脂质体分别介导重组质粒pcDNA3.1(+)-AP-2α和空质粒pcDNA3.1(+)转染SW480细胞,以正常SW480细胞作为空白对照;采用RT-PCR和Western印迹法检测转染48h后各组细胞中AP-2α的表达水平;采用电泳迁移率分析(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)检测转染重组质粒后SW480细胞表达的AP-2α是否具有DNA结合活性;用MTT法研究AP-2α基因转染24、48、72h后SW480细胞的增殖情况;采用流式细胞术分析各组的细胞周期变化,Western印迹法检测细胞内p21/WAF1的表达水平。结果:转染pcDNA3.1(+)-AP-2α重组质粒48h后,SW480细胞内AP-2αmRNA含量以及蛋白水平均显著升高,并且具有较强的DNA结合活性;MTT结果提示,转染AP-2α基因后SW480细胞增殖趋缓;细胞周期分析结果提示,转染AP-2α基因48h后G0/G1期细胞比例较正常细胞增加(P<0.05);转染AP-2α基因48h后,SW480细胞内p21/WAF1表达增加。结论:AP-2α可抑制SW480细胞的增殖,其抑制作用很可能与激活p21/WAF1表达有关。

VIPR1启动子甲基化促进转录因子AP-2α下调VIPR1的表达并促进肝细胞癌的生长

目的探讨血管活性肠肽受体1(VIPR1)在肝细胞癌(HCC)组织中低表达的转录调控机制和生物学功能。方法肝癌细胞系Hep3B和Huh7常规培养,实验分为VIPR1启动子野生型组、启动子突变载体1组、启动子突变载体2组和启动子突变载体1+2组。双荧光素酶报告基因实验检测AP-2α表达对VIPR1启动子活性的影响;DNA甲基化转移酶抑制剂(DAC)处理肝癌细胞,焦磷酸测序法检测VIPR1启动子甲基化水平的变化;染色质免疫共沉淀检测AP-2α与VIPR1启动子的结合能力;Westernblot检测AP-2α的敲减作用以及VIPR1的表达;Westernblot检测两种细胞株中VIPR1的差异表达;qPCR和Westernblot检测VIPR1过表达和敲减效果;流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡;CCK8实验检测细胞增殖。建立裸鼠移植瘤模型,检测LV-NC组和LV-VIPR1组中肿瘤的体积和质量。结果与VIPR1启动子野生型组相比,启动子突变载体1+2与AP-2α表达质粒共转染后,荧光素酶活性明显恢复(P<0.05);DAC处理后,VIPR1启动子甲基化水平降低,并且随着甲基化程度减弱,与VIPR1启动子结合的AP-2α显著减少(P<0.01);敲减AP-2α后,VIPR1表达上升;Huh7细胞株中VIPR1表达低于Hep3B细胞株,在两种细胞株中成功构建了VIPR1过表达和敲减模型,VIPR1过表达增加了G2/M期的细胞数量(P<0.01),凋亡细胞显著增加(P<0.001),细胞增殖受到抑制(P<0.001),而VIPR1敲低则相反。体内实验表明VIPR1过表达组的肿瘤体积减小(P<0.001),肿瘤量降低(P<0.05)。结论HCC中VIPR1的启动子甲基化促进了转录因子AP-2α的结合,并且抑制了VIPR1表达,而VIPR1过表达可使细胞周期阻滞在G2/M期,促进细胞凋亡,抑制细胞增殖和肿瘤生长。

靶向转录因子AP-2的Decoy核酸对肿瘤细胞增殖的抑制作用

ecoy核酸是与靶转录因子具有高亲和性的双链寡聚核酸 ,通过竞争性抑制转录因子与调控区域的结合 ,调控转录来改变下游基因的异常表达 ,从而抑制肿瘤恶性增殖 .用MTT比色法 ,体外筛选结合转录因子AP 2的decoy核酸药物 ,结果K2 0 6对多种肿瘤细胞生长有显著的抑制作用 ,在异植人肿瘤细胞NCI H4 6 0的裸鼠模型中 ,静脉注射高中低三剂量组的decoy核酸K2 0 6 ,抑瘤率分别达 71 8%、6 4 4 %及 5 7 3% (V V) .通过凝胶阻抑试验 ,验证了K2 0 6与转录因子产生特异性结合 .

猪源转录因子AP-2δ通过增强rep基因启动子活性促进猪圆环病毒2型的复制

本研究旨在探究猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2, PCV2)能否借助rep基因启动子区的转录因子结合位点调控自身基因转录,并寻找参与这一调控过程的宿主因子。凝胶迁移实验证实rep基因启动子具有核蛋白结合活性。DNA-pull down联合液相-串联质谱分析鉴定到了可与rep基因启动子结合的猪源转录因子AP-2δ(Porcine transcription factor AP-2δ, poTFAP2δ)。双荧光素酶报告基因试验、实时荧光定量PCR、免疫印迹及间接免疫荧光等试验证明poTFAP2δ不仅可以特异性地增强rep基因启动子活性,而且可以在PCV2感染过程中促进rep和cap基因的转录、翻译及PCV2病毒滴度。文中揭示了PCV2利用宿主蛋白促进自身增殖的分子机制,为进一步从病毒与宿主互作角度阐明PCV2的致病机制提供新的研究思路,亦为PCV2高效疫苗的研制提供理论基础。

TFAP2A对肾小球硬化相关基因ADCK4转录调控机制的研究

目的探索细胞中TFAP2A对局灶节段性肾小球硬化(FSGS)相关基因含aarF结构域的激酶4(ADCK4)的转录调控机制及TFAP2A与ADCK4是否存在特定的结合区域。方法生物信息学分析肾小球硬化基因火山图,ADCK4及TFAP2A表达水平的关系。JASPAR数据库预测ADCK4基因转录起始位点-464 bp/+206 bp区域包含TFAP2A转录因子结合位点;TFAP2A siRNA浓度分别为5、10、15µmol/L,TFAP2A过表达质粒质量浓度分别为50、100、300µg/L,通过双萤光素酶报告基因实验验证TFAP2A对ADCK4基因启动子水平的调控作用。TFAP2A siRNA及TFAP2A过表达质粒转染细胞,实时荧光定量PCR检测TFAP2A、ADCK4 mRNA表达,蛋白免疫印迹实验检测TFAP2A、ADCK4蛋白表达。染色质免疫沉淀试验验证TFAP2A与ADCK4启动子的特定区域结合。结果生物信息学分析显示FSGS肾组织中RNA-Seq RNA表达上调的基因273个,表达下调的基因219个;ADCK4与TFAP2A表达水平呈正相关(P<0.01)。双萤光素酶报告基因实验证明TFAP2A siRNA浓度为10、15µmol/L的ADCK4启动子相对萤光素酶活性增强,TFAP2A过表达质粒质量浓度为100、300µg/L的ADCK4启动子萤光素酶活性降低(P<0.05)。与对照组相比,实验组ADCK4 mRNA和蛋白表达水平升高;过表达实验中,与对照组比较,实验组ADCK4 mRNA和蛋白表达水平降低(P<0.05)。染色质免疫沉淀试验发现TFAP2A能与ADCK4启动子的特定区域结合。结论转录因子TFAP2A负向调控ADCK4基因表达,增加了调控足细胞重要基因的转录因子成员。

TFAP2A对肾小球硬化相关基因NPHS2的转录调控作用观察

目的观察转录因子AP-2α(TFAP2A)对肾小球硬化相关基因NPHS2的转录调控作用。方法基于GEO数据库及GEO Profiles数据集,比较肾透明细胞癌组织与正常肾组织中NPHS2、TFAP2A的表达差异。构建含NPHS2基因5′侧翼区域重组报告质粒,预测NPHS2基因的-519 bp~+20 bp启动子区包含转录因子TFAP2A的结合位点。培养HEK-293T细胞,对照siRNA组转染control siRNA,实验组分别转染TFAP2A siRNA(浓度分别为5、10、15 pmol/µL)和TFAP2A过表达质粒(质量浓度分别为50、100、300 ng/mL),通过双萤光素酶报告基因实验验证TFAP2A对NPHS2基因启动子水平的调控作用。将HEK-293T细胞分为对照组、干扰组及过表达组,分别转染con‐trol siRNA、TFAP2A siRNA及TFAP2A过表达质粒;采用荧光定量PCR检测TFAP2A、NPHS2 mRNA,采用Western blotting法检测NPHS2蛋白。结果肾透明细胞癌组织中TFAP2A、NPHS2表达低于正常肾组织。成功构建含NPHS2基因5′侧翼区域重组报告质粒,NPHS2基因转录起始位点上游-519 bp~+20 bp区域包含两个TFAP2A转录因子结合位点。双萤光素酶报告基因实验结果显示,与对照siRNA组相比,转染5、10、15 pmol/µL TFAP2A siRNA的实验组细胞NPHS2启动子荧光素酶活性均增强,转染300 ng/mL TFAP2A过表达质粒的实验组细胞NPHS2启动子荧光素酶活性降低(P均<0.05)。干扰组NPHS2 mRNA及蛋白表达高于对照组,过表达组NPHS2 mRNA及蛋白表达低于对照组(P均<0.05)。结论NPHS2启动子-519 bp~+20 bp区域存在潜在的TFAP2A转录因子结合位点;TFAP2A可下调NPHS2的启动子活性、mRNA及蛋白表达。

转录因子TFAP2B在健康人及白癜风患者表皮黑色素细胞中的表达模式

目的探究转录因子TFAP2B在健康人及白癜风患者表皮黑色素细胞中的表达模式.方法收集空军军医大学西京皮肤医院2020年1月至2022年12月明确诊断的5例进展期白癜风患者皮损组织,同时收集性别、年龄匹配的5例来源于整形外科手术剩余皮肤组织作为健康对照.培养永生化的健康人表皮黑色素细胞系PIG1、白癜风表皮黑色素细胞系PIG3V及人表皮原代黑色素细胞,其中原代黑色素细胞分离自西京医院泌尿外科手术切除的3例健康男性包皮组织.采用组织免疫荧光检测TFAP2B、多巴色素互变异构酶(DCT)在健康对照皮肤和白癜风皮损中的表达及定位,细胞免疫荧光和Western印迹法检测TFAP2B在人表皮黑色素细胞中的表达.两组间比较采用t检验,相关性分析采用Pearson相关分析法.结果组织免疫荧光结果显示,TFAP2B仅在人表皮黑色素细胞中表达,且定位于细胞核.Western印迹结果显示,TFAP2B在人表皮黑色素细胞系PIG1及原代黑色素细胞中强表达(相对表达量分别为0.45±0.05和0.36±0.04).组织免疫荧光结果显示,在10例人表皮组织(包括5例健康对照和5例白癜风)中,TFAP2B(623917.5±88784.0)与DCT(2232655.3±588810.4)的荧光强度呈显著正相关(r=0.91,P<0.001).此外,TFAP2B在白癜风皮损表皮黑色素细胞中相对荧光强度(0.12±0.05)显著低于健康对照表皮黑色素细胞(1,t=19.35,P<0.001).Western印迹结果显示,TFAP2B在白癜风表皮黑色素细胞系PIG3V中的相对表达值(0.62±0.09)亦显著低于PIG1细胞(1,t=5.92,P<0.027).结论TFAP2B在人表皮黑色素细胞中特异性高表达,其表达与黑色素细胞标记分子DCT的表达呈显著正相关,在白癜风患者表皮黑色素细胞中明显低表达.

AP-2α对大肠癌细胞侵袭生长及ER-β表达的影响

目的:研究转录因子激活蛋白-2α基因(transcription factor activator protein-2α,AP-2α)对大肠癌SW620细胞侵袭生长的影响,并探讨其对雌激素受体β基因(estrogen receptor-β,ER-β)表达的影响及其可能的分子机制。方法:利用脂质体介导重组质粒pcDNA3.1(+)-AP-2α与空质粒pcDNA3.1(+)转染入SW620大肠癌细胞,采用基质胶黏附实验与Transwell实验检测细胞的体外黏附、侵袭生长与迁移能力,采用实时定量PCR、Western blotting、免疫荧光细胞化学检测细胞中AP-2α和ER-β在基因和蛋白水平的表达,以电泳迁移率分析(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)方法检测转染AP-2α基因后肿瘤细胞中AP-2α的DNA结合活性及其与ER-β的结合能力。结果:AP-2α转染SW620细胞后抑制了细胞的体外黏附、侵袭与迁移能力(均P<0.05);同时细胞中ER-β基因的mRNA和蛋白表达水平显著升高(P<0.05);EMSA结果显示,AP-2α转染的SW620细胞中表达的AP-2α蛋白与ER-β基因启动子区域发生特异性结合。结论:AP-2α转染SW620细胞可显著抑制大肠癌SW620细胞体外黏附、侵袭与迁移能力,其分子机制很可能与AP-2α直接作用于ER-β基因启动子区域从而影响ER-β基因的表达有关。

AP-2α对基质金属蛋白酶-20作用的研究

目的:通过研究AP-2α转录因子对基质金属蛋白酶-20(matrix metalloproteinase-20,MMP-20)基因表达的调控作用,进一步明确AP-2α的功能,为研究AP-2α在釉质形成中的作用奠定基础。方法:利用RT-PCR法、双荧光素酶报告基因检测系统、染色体免疫共沉淀技术等来分析AP-2α与MMP-20启动子区域的转录调控能力。结果:小鼠成釉细胞转染AP-2αsiRNA后,成釉细胞中MMP-20 mRNA的表达水平显著上调。染色体免疫共沉淀结果显示,AP-2α可能通过与MMP-20启动子特征性序列相互作用,从而调控MMP-20的表达。双荧光素酶报告基因检测显示预测结合位点突变后,AP-2α对MMP-20启动子的表达水平无显著影响。结论:AP-2α基因沉默可显著上调MMP-20的mRNA表达水平;而AP-2α过表达可显著抑制MMP-20活性。提示AP-2α转录因子与成釉细胞内MMP-20启动子的特征性序列相互作用,从而调控MMP-20的表达水平。

一种AP-2α选择性剪切的发现及其在MCF-7细胞中的功能研究

目的研究AP-2α的一种选择性剪切及其对MCF-7细胞生物学功能的影响。方法构建AP-2α基因表达质粒,得到pAP-2α和一个C-端编码产物完全不同于AP-2α的选择性剪切pAP-2αas表达质粒。通过荧光素酶法检测pAP-2αas和pAP-2α对含存活素(survivin)启动子核心序列的荧光素酶报告质粒pLuc-441活性影响的差异;并通过药物敏感性实验观察pAP-2αas和pAP-2α对乳腺癌细胞MCF-7药物敏感性影响的差异。结果采用荧光素酶法检测共转染pAP-2αas和pLuc-441的MCF-7细胞中survivin启动子活性,与对照pAP-2α相比,pAP-2αas也能抑制pLuc-441活性,但抑制的强度低于前者;药物敏感性实验显示,在MCF-7细胞中,转染pAP-2αas显著提高了药物敏感性,与pAP-2α产生的生物学功能近似。结论 AP-2αas作为一种体内的特异性剪切形式,具有和通常AP-2α相似但不完全相同的功能,推测这是基因表达调控的特殊方式,AP-2α对基因表达的调节在某些情况下可以不通过直接结合启动子发挥作用。

转录因子 AP-2在泌尿生殖系统肿瘤中的研究进展

转录因子激活蛋白-2（AP-2）在肿瘤细胞的增殖、分化、癌变及化疗耐药方面扮演着重要角色。AP-2在不同泌尿生殖系统肿瘤组织中分别呈现出抑癌或促癌的双向调控效应。研究 AP-2在泌尿生殖系统肿瘤中的作用及作用机制可为相关肿瘤的诊治提供新的思路和方向。

转录因子活化蛋白-2α对人脐静脉内皮细胞ECV304细胞凋亡和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3活化的影响

【摘要】目的探讨转录因子活化蛋白-2α（AP-2α）对香烟提取物（CSE）所致半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase 3）的活化及人脐静脉内皮细胞株ECV304凋亡的影响。方法按照不同浓度CSE将ECV304细胞分为0．0％、2．5％、5．0％、10．0％、15．0％、20．0％CSE组；再将5．0％CSE组按照不同处理时间分为0、6、12、18、24、36和48h组，按照不同转染腺病毒载体（Ad）分为Ad-AP-2α组、对照腺病毒载体（Ad-BgⅡ）组和对照组，按照不同转染基因及处理因素分为Ad—AP-2α＋5％CSE 24h组、Ad—BgⅡ＋5％CSE24h组及对照＋5％CSE 24h组。每组3例。采用腺病毒介导的转染、双苯甲亚胺染核和Western blot等方法观察过表达AP-2α对CSE诱导的ECV304凋亡和Caspase 3活化的影响。采用Bartlett法进行方差齐性检验，两组间比较用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，多个样本均数的多重比较采用LSD—t检验，多个样本率的比较采用χ^2检验。结果2．5％CSE组的细胞增殖能力（吸光度值为0．754±0．109）明显高于对照组（吸光度值为0．630±0．086），其余浓度组的细胞增殖能力逐渐下降，并呈浓度依赖的方式。随着5．0％CSE作用时间延长，细胞凋亡率从（5．0±1．0）％逐渐增到（72．6±12．1）％；转染24h时，AP-2α的蛋白相对含量的积分吸光度值（0．882±0．014）明显高于对照组（0．635±0．005）；过表达AP-2α使5．0％CSE诱导的细胞凋亡率从（7．5±0．9）％降至（0．9±0．4）％，Caspase 3蛋白相对含量从0．484±0．025降至0．300±0．020。结论AP-2α可以抑制ECV304细胞中CSE诱导的Caspase 3活化及细胞凋亡。

转录因子激活蛋白-2α、雌激素受体-β和基质金属蛋白酶-9在扁平苔藓皮损中的表达

目的探讨转录因子激活蛋白-2α（AP-2α）、雌激素受体-β（ER-β）和基质金属蛋白酶-9（MMP-9）在扁平苔藓皮损中的表达及意义。方法选取30例扁平苔藓皮损和30例正常人皮肤组织，应用免疫组化SP法观察ER—β和MMP-9的表达，采用RT—PCR和Western印迹法检测AP-2α、ER—β和MMP-9基因及其蛋白水平。结果扁平苔藓皮损中AP-2st、ER-β、MMP-9mRNA的相对表达水平为0．488±0．039、0．365±0．032和1．237±0．027，与正常组织相比，AP-2α、ER—β表达下降（P值均〈0．01），而MMP-9表达升高（P〈0．01）。Western印迹检测结果与RT—PCR相似，即AP-2st、ER-β蛋白表达下降（P值均〈0．01），而MMP-9表达升高。AP-2α的表达与ER—β的表达呈正相关（r=0．89，P〈0．01），与MMP-9的表达呈负相关（r=-0．91，P〈0．01）。结论ER-β表达的下调和MMP-9表达的上调可能是AP-2st表达下调引起调控下游靶基因异常所致，可能为扁平苔藓的发病环节之一。

重叠延伸PCR法构建小鼠Sumf1基因的定点突变真核表达载体

前期通过染色质免疫沉淀技术（chromatin immunoprecipitation assay，CHIP）筛选出了转录因子activator protein．2 alpha（AP-2α）的靶基因Sumf1．采用重叠延伸PCR定点诱变技术，对AP．2α在Sumf1内含子片段上的两个结合位点的碱基进行定点突变，并构建定点突变表达载体．DNA测序表明，Sumf1内含子片段103—111bp，411～419bp两处的碱基已分别由GCCGTCAGG突变为GAAGTCCTG，由GCCTCTAGG突变为GGATCTCTG，成功实现定点诱变，为进一步研究AP-2α对基因Sumf1的表达调控奠定了基础．

动脉导管未闭患儿TFAP-2B基因突变的研究

目的 发现我国动脉导管未闭（patent ductus arteriosus,PDA）患儿分子遗传方面缺陷,为PDA早期预防及遗传咨询提供支持.方法 收集100例单纯性PDA患儿的临床资料和外周静脉血样本,以100名健康儿童为对照.应用聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）扩增TFAP-2B基因的全部外显子和外显子两侧部分内含子,并对扩增片段进行双向测序.应用BLAST程序将所测TFAP-2B基因序列与GeneBank中的已知序列进行对比以检测基因突变.采用逆转录聚合酶链式反应（reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR）对1例家族史阳性患儿及其家属共16人TFAP-2B部分cDNA片段进行扩增,扩增产物直接进行双向序列测定.结果 基因分析显示,在1例家族史阳性患儿及其患病亲属中,TFAP-2B第3内含子剪接位点＋5位发生突变[intron3（＋5）G＞A],患儿TFAP-2B基因部分cDNA巢式PCR扩增结果 提示3号外显子完全缺失.此外,还发现了一个新的单核苷酸多态性,即转录起始点上游第34位的鸟嘌呤变为腺嘌呤,这个多态在PDA患者和健康对照组的频率分布差异有统计学意义（Z=-2.513,P=0.012）.结论 TFAP-2B基因突变能够导致家族型PDA.

AP-2α对大肠癌SW620细胞增生的影响及其作用机制

目的研究转录因子激活蛋白-2d（AP-2α）对大肠癌细胞株SW620增生能力的影响及可能的作用机制。方法构建pcDNA3．1（＋）-AP-2α重组质粒，采用脂质体介导质粒转染人SW620细胞，利用MTT法检测其对SW620细胞增生能力的影响；荧光定量PCR方法和Western印迹法检测转染前后各组细胞中雌激素受体-β（ER-β）表达水平的变化。结果转染AP-2α后SW620细胞内AP-2α mRNA含量及蛋白表达水平显著升高。MTT结果提示，转染AP-2α基因后SW620细胞增生速度受到抑制。转染AP-2α基因后ER-β mRNA和蛋白表达增加，且在转染48h增加最为明显，ER—β mRNA和蛋白质分别增加了94．47％和54．67％，与对照组相比，差异有统计学意义（P〈0．05）。结论AP-2α可抑制SW620细胞的增生，其抑制机制很可能与增强ER-β的表达有关。

AP-2α基因转染对人类结肠癌SW480细胞体外增生及侵袭能力的影响

目的 探讨AP-2α基因对人类结肠癌SW480细胞体外增生及侵袭能力的影响.方法 构建PODNA3.1(+)-AP-2α真核表达载体,利用脂质体介导pcDNA3.1(+)-AP-2α和pcDNA3.1(+)转染5W480细胞,并以正常SW480细胞作为空白对照;采用RT-PCR与Western blotting分别检测转染48 h后各组细胞中AP-2αmRNA与蛋白的表达情况;采用平板克隆、软琼脂克隆形成试验以及Transweil侵袭试验,分别检测各组细胞体外增生及侵袭能力.结果 SW480细胞内源性AP-2α蛋白表达缺失;转染AP-2α基因后,在SW480细胞中可检测到高水平的AP-2αmRNA及蛋白,细胞克隆形成率降低(P<0.05),软琼脂克隆体积小且数量少,细胞侵袭能力下降(P<0.05).结论 转染AP-2α基因可以抑制人类结肠癌SW480细胞的体外恶性增生以及侵袭能力.