降钙素基因相关肽对大鼠成骨细胞表达转录因子RUNX2的影响

目的:探讨外源性降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide,CGRP)对大鼠颅盖骨来源成骨细胞RUNX2因子表达水平的影响,进一步了解CGRP促进成骨的作用机制。方法:用酶消化法培养原代大鼠成骨细胞并鉴定;MTT法筛选促进成骨细胞增殖的有效浓度,将含有不同浓度CGRP的条件培养基加入大鼠成骨细胞培养体系中,药物作用48 h后,用半定量RT-PCR和Western blotting方法检测大鼠成骨细胞转录因子RUNX2在mRNA和蛋白水平的表达。结果:当CGRP浓度在10-8～10-6mol/L范围时,对成骨细胞增殖有明显促进作用,增殖率分别为71.9%,142.1%,321.0%,P<0.05;浓度为10-7和10-6mol/L的CGRP作用于成骨细胞48 h后,转录因子RUNX2在mRNA水平的表达量明显上调,分别增强(46.2±11.2)%和(58.6±14.0)%,P<0.05;转录因子RUNX2的蛋白表达变化趋势与其mRNA的表达变化趋势基本一致。结论:一定浓度的CGRP对大鼠成骨细胞转录因子RUNX2的表达有直接促进作用,RUNX2可能参与了CGRP刺激成骨细胞增殖反应的机制。

大鼠正畸牙移动牙周组织中叉头框蛋白O1和成骨特异转录因子RUNX2的表达

目的:检测大鼠正畸牙移动牙周组织中叉头框蛋白O1(forkhead box O1,Fox O1)和Runt相关转录因子2(runt-related transcription factor 2,Runx2)的表达变化,初步探讨Fox O1和Runx2在正畸牙移动牙周组织改建中的作用及相互关系。方法:将40只8周龄雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠随机分为5组,建立正畸牙移动模型,以上颌左侧加力的第一磨牙为实验侧,右侧不加力的第一磨牙为对照侧。分别加力1、3、5、7、14 d后处死大鼠,解剖分离出含有第一磨牙的牙槽骨制备标本,进行苏木精-伊红(H-E)染色和Fox O1、Runx2免疫组织化学染色,利用Image Pro Plus图像分析系统对染色后的切片做定量分析,采用SPSS 13.0软件包对数据进行统计学处理。结果:Fox O1在牙周膜主要表达于成骨细胞及成牙骨质细胞中,Runx2主要表达于成骨细胞、成纤维细胞及成牙骨质细胞中。实验组加力后,大鼠牙周组织中Fox O1和Runx2的表达增强,在3~5 d内达到峰值,而后表达降低;14 d时与对照组相比无显著差异(P>0.05),其余组与对照组相比均有显著差异(P<0.05)。结论:Fox O1和Runx2参与了正畸牙移动中的牙周组织改建,且主要参与了成骨细胞和骨形成的过程。

敲低Runt相关转录因子2(Runx2)表达抑制结肠癌细胞生长和迁移

目的构建稳定低表达Runt相关转录因子2(Runx2)的HCT-8结肠癌细胞,检测对结肠癌细胞生长和迁移等生物学行为的影响。方法首先采用Western blot法检测Runx2在不同结肠癌细胞系中表达,确定HCT-8结肠癌细胞高表达Runx2;将含有Runx2的慢病毒短发卡RNA(shRNA)的干扰载体与慢病毒包装辅助质粒共转染人胚肾HEK293FT细胞后,收集病毒上清,感染HCT-8结肠癌细胞。经嘌呤霉素筛选后,获得慢病毒介导的Runx2 shRNA的稳定表达细胞,利用实时定量PCR和Western blot法检测Runx2的shRNA的干涉效果;用CCK-8法检测细胞增殖活性、平板克隆形成实验检测癌细胞生长、Transwell^(TM)侵袭实验和划痕愈合实验检测Runx2 shRNA转染对癌细胞侵袭和迁移的影响。结果建立了稳定敲低Runx2水平的HCT-8结肠癌细胞;敲低HCT-8细胞Runx2表达水平后,癌细胞的生长、侵袭和迁移受到明显抑制。结论敲低Runx2抑制结肠癌细胞的生长、侵袭和迁移。

重组腺病毒CXCL12基因表达载体的构建及其转染间充质干细胞后对其Runx2基因表达的影响

目的:构建趋化因子CXCL12的重组腺病毒表达载体,观察其对间充质干细胞(MSC)中成骨特异性转录因子Runx2表达的影响。方法:将目的基因CXCL12全长c DNA模板进行PCR扩增、酶切后与p HBAd-MCMV-GFP载体结合,获得p HBAd-MCMV-CXCL12-GFP重组载体;将重组载体和包装质粒共转染HEK293细胞进行包装、扩增;利用所携带的绿色荧光蛋白基因测定病毒滴度,观察基因转染效率,QPCR和Western印迹检测CXCL12重组腺病毒转染后MSC中CXCL12和Runx2的表达。结果:酶切、PCR及测序结果证实CXCL12重组腺病毒载体构建成功,转染MSC后CXCL12和Runx2的表达明显升高,AMD3100可以降低CXCL12基因转染后MSC中Runx2的表达。结论:趋化因子CXCL12和MSC表面的CXCR4结合对MSC中成骨特异性转录因子Runx2的表达具有促进作用。

神经肽P物质通过诱导RUNX2表达对小鼠成骨细胞增殖能力的影响

目的·探讨神经肽P物质(SP)对转录因子RUNX2表达的调控及其对成骨细胞增殖能力的影响。方法·体外分离C57BL/6J小鼠颅骨来源的原代成骨细胞,通过转染si RNA沉默成骨细胞RUNX2基因的表达。将SP、Spantide(SP抑制剂)、L703606(NK-1受体抑制剂)以及RUNX2 si RNA进行配伍作用于成骨细胞,观察SP对成骨细胞RUNX2表达的调控及对成骨细胞增殖能力的影响。成骨细胞增殖活性的检测采用细胞增殖-毒性检测试剂盒(CCK-8法)。通过real-time PCR和Western blotting技术检测SP对RUNX2在m RNA和蛋白表达水平的调控。结果·CCK-8法检测结果显示,浓度为10^(-12)~10^(-6) mol/L的SP促进小鼠成骨细胞增殖,10^(-8) mol/L为其最佳浓度。10^(-8) mol/L SP作用于成骨细胞48 h后,转录因子RUNX2的m RNA和蛋白表达水平较对照组明显升高,Spantide和L703606抑制SP对RUNX2表达的诱导。RUNX2 si RNA降低成骨细胞基础增殖水平,同时也抑制了SP对成骨细胞的促增殖作用。结论·SP通过与NK-1受体结合诱导转录因子RUNX2的表达,进而增强成骨细胞增殖能力。

miR-30a-5p通过靶向Runx2基因抑制成骨细胞分化

目的:构建绝经后骨质疏松大鼠模型,分析miR-30a-5p在成骨细胞分化中的功能。方法:将SD大鼠分为雌激素组、假手术组和模型组;取胫骨组织进行miRNA测序并差异表达分析;检测miR-30a-5p在各组大鼠骨中的表达含量;通过qRT-PCR检测miR-30a-5p表达对成骨分化标记相关蛋白胶原Ⅰ、骨钙素(OCN)和骨桥蛋白(OPN)表达的影响,同时检测对碱性磷酸酶(ALP)活性的影响;双萤光素酶报告基因检测miR-30a-5p对RUNT相关转录因子2(Runx2)的靶向调控作用。结果:miRNA测序分析结果显示,相对于假手术组、雌激素组,模型组有33种共同miRNA表达上调,选取miR-30a-5p作为本研究对象;qRT-PCR进一步验证miR-30a-5p在模型组骨组织中高表达;miR-30a-5p靶向抑制Runx2的表达,且能够抑制OCN、OPN和胶原Ⅰ的表达,降低ALP活性;而同时过表达Runx2后,OCN、OPN和胶原Ⅰ的表达升高,ALP活性增加,Runx2过表达部分缓解miR-30a-5p对成骨细胞分化的抑制作用。结论:miR-30a-5p在骨质疏松大鼠骨组织中表达上调,并能够靶向抑制Runx2的表达,从而抑制成骨细胞分化,促进骨质疏松进展,为骨质疏松症的诊断提供新的生物标志物。

FASN、Runx2在老年脑胶质瘤患者中表达及与临床病理特征、预后生存的相关性

目的分析脂肪酸合成酶(FASN)、人类runt相关转录因子(Runx)2在老年脑胶质瘤患者中的表达及与临床病理特征、预后生存的相关性。方法选取67例老年脑胶质瘤组织及相关临床资料,最终65例满足纳入标准作为研究组。选取同期收治的50例脑胶质瘤癌旁相对正常标本及相关临床资料作为对照组。比较两组FASN、Runx2表达水平,分析FASN、Runx2与老年脑胶质瘤患者各病理参数的相关性,采用多元Logistic回归分析影响老年脑胶质瘤患者预后生存的危险因素,采用受试者工作特征(ROC)曲线分析影响老年脑胶质瘤患者预后生存的预测价值。结果研究组FASN、Runx2高表达率显著高于对照组(P<0.001);老年脑胶质瘤患者FASN、Runx2水平与组织分化类型、组织学分级、远处转移有关(P<0.05),与年龄、肿瘤直径、病理类型、肿瘤部位等无关(P>0.05);对65例患者进行2年随访发现,生存46例,死亡19例,预后不良率为29.23%。死亡组FASN、Runx2高表达率显著高于生存组(P<0.05);经多元Logistic回归分析显示,组织中低分化、组织学分级:Ⅲ+Ⅳ、FASN、Runx2高表达是影响老年脑胶质瘤患者预后生存的独立危险因素(P<0.05),FASN、Runx2蛋白及两者联合曲线下面积分别为0.666、0.781、0.798,各指标曲线下面积以联合检测最大。结论老年脑胶质瘤患者FASN、Runx2呈高表达状态;FASN、Runx2与患者预后生存关系密切,可作为预测老年脑胶质瘤患者预后的分子标志物和肿瘤治疗的潜在靶点。

淫羊藿苷通过上调Runx2促进踝关节骨折大鼠骨重建及抑制破骨细胞形成

【目的】观察淫羊藿苷对踝关节骨折大鼠的治疗作用及机制。【方法】取55只SD大鼠,建立踝关节骨折模型。将成功造模的全部50只大鼠随机分为模型组,淫羊藿苷低、中、高剂量组及阳性药组,每组10只。淫羊藿苷低、中、高剂量组分别给予腹腔注射淫羊藿苷30、60、120 mg/kg,阳性药组给予腹腔注射复方骨肽注射液0.4 mL/kg,模型组给予腹腔注射等体积生理盐水,每日1次,连续给药4周。给药结束后,进行Micro-CT活体扫描及生物力学测试,采用抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色法检测骨痂组织破骨细胞数量,苏木素-伊红(HE)染色法观察骨痂组织病理学变化,采用Western Blot法检测骨痂组织Runt相关转录因子2(Runx2)蛋白表达量。【结果】与模型组比较,淫羊藿苷低、中、高剂量组和阳性药组干预2、4周后骨小梁数量(Tb.N)、最大载荷、刚度、骨体积分数(BV/TV)值及骨痂组织Runx2蛋白表达量升高,骨痂组织破骨细胞数量减少(P<0.05),淫羊藿苷各剂量组作用效果呈剂量依赖性;但淫羊藿苷各剂量组干预2、4周后Tb.N、最大载荷、刚度、BV/TV值及骨痂组织Runx2蛋白表达量均低于同期阳性药组,骨痂组织破骨细胞数高于阳性药组(均P<0.05)。【结论】淫羊藿苷可促进踝关节骨折创伤大鼠骨重建,抑制破骨细胞形成,提高生物力学性能,其作用机制可能与上调Runx2蛋白表达有关;但其作用效果不及复方骨肽注射液。

亚慢性氟中毒对大鼠骨组织Runx2 mRNA表达的影响

目的观察亚慢性氟中毒对大鼠骨组织中转录因子Runx2 mRNA表达的影响,探讨Runx2在氟骨症发生中的可能作用。方法 40只Wistar大鼠按体重随机分成4组,染氟组大鼠饮用含氟50、100、150 mg/L的自来水,对照组大鼠饮用自来水;3个月后测定大鼠血清及骨组织氟含量,并采用SYBR Green Real-time RT-PCR法检测骨组织中Runx2 mRNA表达情况,同时观察骨组织病理学改变。结果 HE染色显示染氟组大鼠呈现骨皮质增厚、骨小梁增多等骨硬化表现;染氟组大鼠骨组织中Runx2 mRNA表达显著高于对照组,且随染毒剂量升高,表达亦逐渐升高。结论过量的氟可能通过增加骨组织Runx2基因表达水平来促进间充质干细胞向成骨细胞系分化,使骨形成增加。

氯沙坦抑制大鼠主动脉血管钙化的机制

目的观察血管紧张素Ⅱ受体1(AT1R)阻断剂氯沙坦对大鼠主动脉血管钙化的影响,并探讨其可能的作用机制。方法 SD大鼠分对照组、模型组和治疗组,给予华法林和维生素K1皮下注射连续2周建立大鼠主动脉血管钙化模型,治疗组于第1周末给予氯沙坦(10 mg/kg)皮下注射,连续1周。HE染色观察血管壁形态学变化、茜素红染色观察钙盐沉积情况;反转录PCR检测骨形成蛋白2(BMP2)和Runt相关转录因子2(RUNX2)mRNA水平,Western blot法检测BMP2、RUNX2蛋白水平,原位末端转移酶标记技术(TUNEL)检测平滑肌细胞(SMC)凋亡,免疫荧光组织化学染色观察AT1R的定位。结果华法林和维生素K1可诱导主动脉血管钙化;与模型组相比,氯沙坦治疗组BMP2、RUNX2 mRNA和蛋白质表达显著下调,血管壁SMC凋亡和AT1R表达显著性减少。结论 AT1R阻断剂氯沙坦抑制SMC凋亡、降低AT1R表达,下调RUNX2、BMP2表达抑制血管钙化。

阿仑膦酸钠联合辛伐他汀通过Wnt/β-catenin信号通路对去卵巢骨质疏松大鼠的影响

目的观察研究阿仑膦酸钠联合辛伐他汀对去卵巢骨质疏松大鼠骨组织Wnt/β-catenin信号通路的影响,探讨其防治骨质疏松的作用机制。方法65只雌性SD大鼠随机分为对照组、模型组、A药组、B药组和A+B药组,构建去卵巢骨质疏松大鼠模型,分别检测各组骨组织骨密度(BMD)、骨生物力学指标以及骨组织Wnt、β-catenin、Runx2的mRNA和蛋白表达,观察骨组织形态学。结果模型组骨组织BMD、最大载荷和最大应力较对照组均显著降低(P<0.05),A药组、B药组和A+B药组骨组织BMD、骨生物力学指标较模型组均显著增加(P<0.05)。模型组骨组织Wnt、β-catenin、Runx2 mRNA和蛋白较对照组均显著降低(P<0.05),A药组、B药组和A+B药组骨组织mRNA和蛋白较模型组均显著升高(P<0.05)。模型组骨小梁形态结构差,数量少,排列紊乱;A+B药组骨小梁结构完整,数量增多,排列规则。结论阿仑膦酸钠联合辛伐他汀可能通过激活Wnt/β-catenin信号通路相关因子的表达,增加骨质疏松大鼠骨密度,提高骨生物力学,改善骨组织微结构,发挥抗骨质疏松作用。

人参-三七-川芎提取物对高糖诱导小鼠血管老化后α-SMA和Runx2蛋白表达的影响

目的:为了研究人参-三七-川芎提取物(GNC)对高糖诱导小鼠血管老化后α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和runt相关转录因子2(Runx2)蛋白表达的调控作用,阐明GNC延缓血管老化的保护作用机制。方法:C57BL/6小鼠,130只,雄性,随机分为正常组和高糖组。高糖组腹腔注射链脲佐菌素(STZ),造模成功后,喂食高脂饲料7个月,之后再次随机分为模型组,GNC低、高剂量组(0.819,1.638 g·kg^-1)及二甲双胍组(150 mg·kg^-1)。灌胃给药,每天1次,连续9周。取材前7 d,新购一批4周龄雄性C57BL/6小鼠正常喂养1周,为青年组。观察小鼠一般情况,实验结束后分别用苏木素-伊红(HE)染色结合透射电镜(TEM)观察小鼠颈总动脉形态学变化,马松(Masson)染色观察小鼠颈总动脉纤维化,免疫组化检测小鼠颈总动脉中基质金属蛋白酶-2(MMP-2),周期蛋白依赖激酶抑制因子2A(p16),周期依赖性蛋白激酶抑制因子1A(p21),α-SMA与Runx2蛋白表达。结果:HE,TEM,Masson 3个实验结果显示:与青年组比较,正常组小鼠颈总动脉中内外膜厚度、超微结构和血管壁中胶原和弹性纤维的相对含量几乎无变化;与正常组比较,模型组小鼠颈总动脉内膜不光滑,内皮细胞几乎完全脱落,胞质裂解,内弹性膜变薄、断裂、甚至脱离,可见增生的胶原纤维潜入中膜,中外膜增生明显且排列紊乱(P<0.01),血管平滑肌细胞变形、突起、分叉增多、甚至碎裂,并可见局灶性坏死,细胞内空泡和溶酶体等大量增多,并可见明显的自噬泡。血管壁中外膜胶原和弹性纤维的相对含量增加明显(P<0.01);与模型组比较,各给药组以上病理情况均有所改善(P<0.01)。免疫组化结果显示:与正常组比较,模型组小鼠颈总动脉MMP-2,p16,p21,Runx2高表达(P<0.01),α-SMA低表达(P<0.01);与模型组比较,各给药组各蛋白表达趋于正常(P<0.05,P<0.01)。结论:高糖能够诱导小鼠颈总动脉血管老化,改变α-SMA,Runx2蛋白表达。GNC可通过调节α-SMA,Runx2蛋白表达,延缓血管老化。

蚊母草提取物通过抑制Runx2活性抗乳腺癌破骨性骨转移作用

目的:研究蚊母草提取物(EVP)的抗乳腺癌破骨性骨转移作用。方法:采用左心室注射肿瘤细胞法建立裸鼠骨转移模型,通过巢式聚合酶链式反应(PCR)检测裸鼠骨髓组织中人细胞角蛋白-19(Ck-19)基因表达量确定肿瘤细胞的骨转移程度及EVP的抑制作用;采用多核细胞计数法及组织蛋白酶K(Cathepsin K)分泌量检测法,确定小鼠破骨细胞前体骨髓巨噬细胞(BMMs)的活性,并观察EVP(40、80、160 g·L^(-1))的抑制作用;采用蛋白免疫印迹法(Western blot)观察EVP对BMMs细胞内核转录因子-κB受体活化因子(RANK)、Runt相关转录因子2(Runx2)、磷酸化Runx2(p-Runx2)及其下游蛋白基质金属蛋白酶-9(MMP-9)表达的影响;采用明胶酶谱法检测EVP对基质金属蛋白酶(MMPs)水解明胶活性的影响。结果:与空白组比较,裸鼠给予EVP 5.5、11、22 g·kg^(-1),其骨髓组织中人Ck-19水平明显降低(P<0.05),提示EVP具有抗骨转移作用;体外实验显示,与空白组比较,可溶性核转录因子-κB受体活化因子配基(sRANKL)可诱导BMMs分化为多核细胞(P<0.05),EVP(40、80、160 g·L^(-1))可显著抑制上述sRANKL诱导的多核细胞形成(P<0.01)。与空白组比较,sRANKL可显著增加BMMs的Cathepsin K分泌(P<0.01);与sRANKL组比较,EVP组Cathepsin K分泌量明显下调(P<0.05)。Western blot显示,与空白组比较,sRANKL可显著增加BMMs细胞RANK表达(P<0.01);与sRANKL组比较,EVP组(40、160 g·L^(-1))BMMs细胞表达RANK蛋白明显降低(P<0.05)。与空白组比较,sRANKL可明显增加BMMs细胞p-Runx2和MMP-9表达(P<0.05);与sRANKL组比较,EVP组(40、160 g·L^(-1))BMMs细胞表达的p-Runx2和MMP-9蛋白明显降低(P<0.05)。明胶酶谱显示,与空白组比较,sRANKL可明显增加pro-MMP-9、pro-MMP-2及64 kDa MMP-2水平(P<0.05);与sRANKL组比较,EVP组pro-MMP-9、64 kDa MMP-2水平明显降低(P<0.05),且160 g·L^(-1)EVP处理可明显降低pro-MMP-2水平(P<0.05)。结论:蚊母草提取物可抑制肿瘤细胞诱导的破骨性骨转移,抑制骨形成相关转录因子Runx2活化,进而干扰RANK/RANKL信号转导从而抑制破骨细胞活化可能是其作用机制之一。

低强度脉冲超声促进MC3T3-E1成骨分化的机制研究

目的探讨低强度脉冲超声(LIPUS)促进成骨细胞MC3T3-E1成骨分化的机制研究。方法采用LIPUS辐照小鼠MC3T3-E1成骨细胞系(30 mW/cm^(2)、1.5 MHz、25 min/d)。在光学显微镜下观察24 h后成骨细胞形态,通过镁离子探针Mag-Fluo-4 AM染色,实时观察LIPUS干预对成骨细胞镁离子内流的影响。通过碱性磷酸酶(ALP)染色及茜素红染色检测LIPUS对成骨细胞矿化能力的影响。通过实时定量-聚合酶链式反应(PCR)检测LIPUS对ALP和RUNT相关转录因子2(RUNX2)相对表达量的影响。结果经过LIPUS辐照25 min/d后,小鼠成骨细胞胞浆饱满,细胞间彼此连接增多,细胞密度相比对照组提高。相比对照组,LIPUS处理后小鼠成骨细胞中镁离子探针阳性细胞面积增加[(16.81±3.70)%vs(4.94±1.85)%],差异具有显著统计学意义(P<0.01)。相比只使用成骨诱导液的对照组,连续LIPUS刺激的实验组显著增加了ALP阳性细胞面积[(51.80±3.60)%vs(11.38±2.33)%],差异具有显著统计学意义(P<0.01)。此外,与对照组相比,LIPUS刺激显著增加了矿化结节阳性的细胞面积[(39.24±7.57)%vs(1.54±0.41)%],差异具有显著统计学意义(P<0.01)。表明LIPUS干预可以显著增强成骨细胞ALP表达及矿化能力。实时定量-PCR结果显示,LIPUS刺激后,成骨细胞ALP表达增加(2.79±0.48)倍,相比阴性对照组显著增加(P<0.01);LIPUS组RUNX2表达增加(18.22±1.35)倍,相比阴性对照组显著增加(P<0.01)。结论LIPUS促进镁离子内流,上调成骨相关标志物ALP、RUNX2表达量,从而促进成骨细胞矿化及钙沉积。

miRNA-130b-3p促进血管钙化的机制研究

为了确定miRNA-130b-3p在血管钙化中的作用,文章通过使用维生素D_(3)(VD_(3))诱导野生型(WT)雄鼠中膜钙化,收集小鼠全主动脉和肾脏分析钙化进程、miRNA-130b-3p以及成骨转录因子的表达,并在体外向人主动脉平滑肌细胞(human aortic smooth muscle cells,HASMCs)转染miRNA-130b-3p mimic和antagomir,使用高磷酸盐(3.0 mmol/L)诱导钙化,通过Western Blot、实时荧光定量聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)、免疫荧光来确定相关基因表达变化。从WT小鼠分离主动脉并剪成5 mm小段,转染miRNA-130b-3p分析钙化水平,通过流式细胞荧光分选技术(fluorescence activated cell sorting,FACS)分析钙化时HASMCs凋亡。结果发现,miRNA-130b-3p在钙化时表达显著上升并且miRNA-130b-3p的表达与钙化进程显著相关,当过表达时miRNA-130b-3p促进钙化,相反的抑制miRNA-130b-3p则可以抑制钙化,进一步发现miRNA-130b-3p通过介导重组人骨形态发生蛋白-2(bone morphogenetic protein-2,BMP2)通路和Runt相关转录因子2(RUNX2)的表达来影响钙化,并且通过促进细胞凋亡来进一步影响钙化。结果表明miRNA-130b-3p作为钙化上游信号促进血管钙化。

基于分子对接的方法探讨桑根酮C对MC3T3-E1细胞的作用

目的:观察桑根酮C(SanC)对地塞米松(DEX)作用下小鼠MC3T3-E1成骨细胞增殖与分化的影响,并探讨其作用机制。方法:将SanC与同源建模所得的Runt-相关转录因子2(Runx2)蛋白结构进行分子对接。不同浓度SanC(8,16,32μmol·L^-1)和1μmol·L^-1DEX共同作用MC3T3-E1细胞,而后采用细胞增殖-毒性检测试剂盒(CCK-8)法检测SanC对MC3T3-E1成骨细胞增殖影响。试剂盒测定MC3T3-E1成骨细胞碱性磷酸酶(ALP)活性和茜素红染色检测骨矿化结节的形成。采用实时荧光定量聚合酶链反应(Real-time PCR)检测Runt-相关转录因子2(Runx2),ALP,和锌指结构转录因子(Osterix)mRNA的表达水平。蛋白免疫印迹法(Western blot)检测Runx2蛋白表达。结果:SanC与Runx2对接打分为-9.78。与正常组比较,DEX组显著降低细胞存活率(P<0.01),其中7 d存活率差异达到最大;与DEX组比较,SanC能显著促进MC3T3-E1的细胞增值(P<0.01),其中32μmol·L^-1SanC作用细胞7 d增殖率差异达到最大。与正常组比较,DEX组Runx2,ALP和Osterix mRNA的表达均有一定程度升高(P<0.05);与DEX组比较,不同浓度SanC组依赖性上调Runx2,ALP和Osterix mRNA的表达(P<0.01)。与正常组比较,DEX组Runx2蛋白表达明显下降(P<0.05);与DEX组比较,SanC干预下细胞Runx2蛋白表达显著升高(P<0.01)。结论:桑根酮C能促进MC3T3-E1成骨细胞增殖、分化和矿化,其机制可能与上调Runx2表达有关。

鸡胚成骨细胞分离培养方法的建立

为了寻找一种可以获得大量高纯度、活力强的鸡胚成骨细胞(osteoblast,OB)的分离培养方法,利用胰蛋白酶和Ⅱ型胶原酶2次消化法分离18日龄鸡胚颅盖骨细胞。CCK-8法、台盼蓝染色对其进行增殖和活性鉴定;碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)和茜素红染色(alizarin red staining)对其进行特异性染色鉴定;实时荧光定量PCR扩增检测鸡胚OB标志性基因Runt相关转录因子2(Runt-related transcription factor 2,Runx2)、ALP、成骨细胞特异性转录因子(osteoblast specific transcription factor,OSX)mRNA的表达。结果显示,分离的细胞活性较强,具有良好的增殖能力,ALP和茜素红染色均呈强阳性,能高表达ALP、Runx2、OSX基因;表明所分离的颅盖骨细胞具有OB特性,活性强,纯度高,为进一步探讨家禽骨骼疾病的发生及防控机制奠定基础。